李 靜，陳保民

(河南省安陽市中心血站 455000)

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·臨床探討·

4種放散方法解離免疫球蛋白G抗體效果比較

李 靜，陳保民

(河南省安陽市中心血站 455000)

目的 比較乙醚放散、凍融放散、熱放散及枸櫞酸放散4種技術(shù)對RhD免疫球蛋白(Ig)G抗體的放散效果。方法 采用乙醚放散、凍融放散、熱放散及枸櫞酸放散4種放散技術(shù)分別進(jìn)行RhD IgG抗體的放散，放散液進(jìn)行抗體效價(jià)測定及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；將2014年1～5月臨床確診為Rh新生兒溶血病的16例標(biāo)本分別用4種方法進(jìn)行放散，比較抗體檢出率及臨床診斷吻合度。結(jié)果 不論放散細(xì)胞上抗體的致敏性強(qiáng)弱，乙醚放散與枸櫞酸放散解離抗體效果最好，其次是凍融放散，最弱的是熱放散；4種方法的特異性均為100%；敏感性方面，乙醚放散與凍融放散和熱放散比較，t值分別為4.11和9.34，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乙醚放散與枸櫞酸放散比較，t值為0.826，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.5)；臨床16例Rh新生兒溶血病標(biāo)本，乙醚放散與枸櫞酸放散檢出全部抗體，而凍融放散漏檢2例，熱放散漏檢3例。結(jié)論 對于RhD IgG抗體的放散，乙醚放散與枸櫞酸放散在特異性、敏感性及準(zhǔn)確性方面相似且均優(yōu)于凍融放散和熱放散。

IgG抗體放散； 乙醚放散； 凍融放散； 熱放散； 枸櫞酸放散

抗體釋放試驗(yàn)是診斷新生兒溶血病3項(xiàng)試驗(yàn)中最具有價(jià)值的一項(xiàng)試驗(yàn)。通常ABO血型免疫球蛋白(Ig)M抗體以熱放散法為常用，Rh血型IgG抗體以乙醚放散法為常用[1]。由于乙醚易燃、低毒、麻醉的特殊性，受到公安部門管制。為了能找到一種與乙醚放散效果相接近的放散技術(shù)，本文選擇了凍融放散、熱放散及枸櫞酸放散3種放散技術(shù)與乙醚放散進(jìn)行RhD IgG抗體的放散效果比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1～5月臨床確診為Rh新生兒溶血病的16例標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑 普通離心機(jī)(TDZ4-WS，湖南賽特湘儀)；細(xì)胞洗滌離心機(jī)(KA-2200，日本久保田)；37 ℃、56 ℃水浴箱(HH-600，蘇州威爾)；4 ℃藥用冷藏柜[MPR-312D(CN)-C，大連三洋]；-30 ℃低溫保存箱(MDF-U338-C，大連三洋)；快速混勻器(SK-1，蘇州金壇)；酸度計(jì)(PHS-25，上海虹益)；IgG抗-D(20130930，上海血液生物醫(yī)藥公司)；生理鹽水(20130923，山東華魯制藥公司)；無水乙醚；O細(xì)胞(201545303，上海血液生物醫(yī)藥公司)；多特異性抗人球蛋白試劑(20130904，上海血液生物醫(yī)藥公司)；枸櫞酸(20131016，天津天力)；磷酸三鉀(20130320，天津科密歐)；HCL(130406，開封開化)；磷酸三鈉(20110103，天津天力)。

1.3 方法

1.3.1 致敏紅細(xì)胞的制備 隨機(jī)抽取O型RhD陽性無償獻(xiàn)血紅細(xì)胞標(biāo)本10份混勻，經(jīng)洗滌后制成壓積紅細(xì)胞，分成3份備用。取兩份壓積紅細(xì)胞分別與IgG抗-D試劑以1∶1、1∶3比例混勻，置37 ℃水浴10 min后再次洗滌至少6次制成致敏壓積紅細(xì)胞。最后一次洗滌時(shí)的上清液與相應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)為陰性，且致敏紅細(xì)胞做直抗試驗(yàn)結(jié)果為1∶1比例凝集度小于或等于2+、1∶3比例凝集度大于3+方為合格。

1.3.2 陰性對照紅細(xì)胞的制備 將1.3.1步驟中剩余的一份洗滌壓積紅細(xì)胞做直抗試驗(yàn)，結(jié)果為陰性即可作為陰性對照紅細(xì)胞。

1.3.3 乙醚放散和熱放散試驗(yàn) 取適量致敏壓積紅細(xì)胞與陰性對照紅細(xì)胞按照《免疫血液學(xué)》[2]第十二章“放散試驗(yàn)”方法平行放散5次，放散液進(jìn)行IgG抗體效價(jià)測定。

1.3.4 凍融放散和枸櫞酸放散試驗(yàn) 取適量致敏壓積紅細(xì)胞與陰性對照紅細(xì)胞按照《實(shí)用血液免疫學(xué)血型理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[3]第三十章“吸收放散試驗(yàn)”方法平行放散5次，放散液進(jìn)行IgG抗體效價(jià)測定。

1.3.5 將16例標(biāo)本分別用4種方法進(jìn)行放散，比較4種方法的抗體檢出率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料以率表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 將凝集強(qiáng)度為強(qiáng)陽性(>3+)和弱陽性(≤2+)的致敏壓積紅細(xì)胞及陰性對照紅細(xì)胞分別用4種方法進(jìn)行放散。陰性對照紅細(xì)胞放散結(jié)果為陰性，強(qiáng)陽性和弱陽性的致敏壓積紅細(xì)胞均放散出抗體。放散液IgG抗體效價(jià)測定及紅細(xì)胞凝集強(qiáng)度積分結(jié)果見表1。

表1 4種放散方法IgG抗體效價(jià)及凝集強(qiáng)度積分結(jié)果

2.2 4種放散方法敏感性及特異性比較 4種放散方法所得放散液中IgG抗體的平均凝集積分見表2。表明4種放散技術(shù)放散IgG抗體的特異性均為100%；就敏感性而言，不論致敏紅細(xì)胞的凝集度強(qiáng)弱，乙醚放散與枸櫞酸放散比較;乙醚放散與凍融放散和放散比較，t值為0.826，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且均明顯高于凍融放散和熱放散，t值分別為4.11和9.34，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 4種放散方法放散液中抗體效價(jià)平均積分比較(分)

2.3 16例臨床標(biāo)本4種放散方法的檢測結(jié)果 乙醚放散與枸櫞酸放散16例陽性標(biāo)本的檢出率為100.0%，而凍融放散漏檢2例，熱放散漏檢3例。見表3。

2.4 4種方法放散過程中壓積紅細(xì)胞及放散液狀態(tài) 凍融放散所需的壓積紅細(xì)胞量最多，但所得放散液最少。而對于放散液狀態(tài)，乙醚放散、凍融放散的放散液顏色暗紅、渾濁、不透明；加熱放散的放散液雖為櫻紅色，但透明度仍不高；枸櫞酸放散的放散液狀態(tài)最好，為極淺透明紅色。見表4。

表3 16例臨床標(biāo)本4種放散方法的檢測結(jié)果

表4 4種方法放散過程中壓積紅細(xì)胞及放散液狀態(tài)比較

3 討 論

實(shí)驗(yàn)室用于抗體放散的方法主要有熱放散法、凍融放散法、超聲放散法、微波放散法等物理方法，也有乙醚法、枸櫞酸法、氯仿法、二氯甲烷法、三氯乙烯-三氯甲烷法、磷酸氯喹法等化學(xué)方法[4-5]。其中氯仿法是一種能同時(shí)放散IgG和IgM抗體的試驗(yàn)方法，很早便被美國血庫協(xié)會(huì)的工具書列為常規(guī)方法，但氯仿在使抗體解離的同時(shí)會(huì)使紅細(xì)胞本身蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性[6]，同時(shí)含氯試劑有毒，容易造成人員和環(huán)境污染；超聲放散法和微波放散法操作時(shí)需要特殊儀器；對于磷酸氯喹放散法，試劑易殘留，影響試驗(yàn)結(jié)果。所以本文選擇了兩種物理放散法(熱放散、凍融放散)和兩種化學(xué)放散法(乙醚放散、枸櫞酸放散)進(jìn)行放散效果的比較。

根據(jù)表1可以看出，不論放散細(xì)胞上抗體的致敏性強(qiáng)弱，乙醚放散與枸櫞酸放散的放散效果最好，其次是凍融放散，最弱的是熱放散。經(jīng)過計(jì)算放散液中IgG抗體的平均凝集積分，4種方法放散IgG抗體的特異性均為100%；但就敏感性而言，乙醚放散與凍融放散和熱放散比較，t值分別為4.11和9.34，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乙醚放散與枸櫞酸放散比較，t值為0.826，且均明顯高于凍融放散和熱放散技術(shù)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.5)。為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，將臨床確診為Rh新生兒溶血病的16例標(biāo)本分別用4種方法進(jìn)行抗體放散，結(jié)果乙醚放散與枸櫞酸放散的抗體檢出率均為100.00%，而凍融放散漏檢2例，熱放散漏檢3例。鄭凌等[7]也對臨床患者紅細(xì)胞熱放散與酸放散的檢測結(jié)果進(jìn)行了比較，顯示熱放散的放散效果明顯差于酸放散。

比較4種方法放散過程中壓積紅細(xì)胞及放散液狀態(tài)可以看出，由于乙醚放散、凍融放散和熱放散中的放散細(xì)胞均受到了不同程度的破壞，造成放散液透明度不高，影響鹽水、酶法及凝聚胺一步法試驗(yàn)結(jié)果的觀察。而且凍融放散所需紅細(xì)胞較多，如果放散液需要進(jìn)行抗體鑒定，需要大量的紅細(xì)胞才能滿足試驗(yàn)需求。枸櫞酸放散的原理是解離紅細(xì)胞膜上致敏的IgG抗體對紅細(xì)胞進(jìn)行抗原鑒定，因此紅細(xì)胞膜破壞程度輕，放散后的紅細(xì)胞還可進(jìn)行其他試驗(yàn)，所得放散液量多且清澈，不影響各種方法凝集試驗(yàn)結(jié)果的直接觀察。但值得注意的是該方法需在進(jìn)行振搖前才能加入枸櫞酸溶液，加入時(shí)間過長會(huì)使紅細(xì)胞溶血。同時(shí)，該方法可破壞Kell系統(tǒng)抗原，放散后的細(xì)胞不能進(jìn)行Kell系統(tǒng)定型實(shí)驗(yàn)。

對于RhD IgG抗體的放散，乙醚放散與枸櫞酸放散在特異性、敏感性及準(zhǔn)確性方面相接近，且均優(yōu)于凍融放散和熱放散。但作為兩種物理放散方法，凍融放散和熱放散制備抗體最容易。因此，在臨床實(shí)踐中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適合的方法，才能得到理想的結(jié)果。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.058

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1672-9455(2015)13-1947-03

2015-01-20

2015-03-12)