□ 劉永麗

根據(jù)藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(2010年修訂)，無菌原料藥工藝是指法定標(biāo)準(zhǔn)中列有無菌檢查項目的原料藥，應(yīng)最大限度地控制微生物［1］。無菌結(jié)晶原料藥是指采用結(jié)晶精制工藝進(jìn)行生產(chǎn)的非最終滅菌原料藥，其生產(chǎn)工藝通常為粗品溶解后經(jīng)過除菌過濾進(jìn)入結(jié)晶釜結(jié)晶，過濾烘干后進(jìn)行分裝，且還包括輔助工序。無菌結(jié)晶原料藥的工藝模擬試驗(Process simulation validation)通常是指使用合適的空白物料或微生物生長培養(yǎng)基，運用與無菌物料生產(chǎn)方法相接近的方法評估無菌工藝。［7］無菌工藝模擬試驗確定無菌工藝生產(chǎn)系統(tǒng)是否有染菌風(fēng)險，即培養(yǎng)基模擬灌裝試驗［1］。

一、無菌結(jié)晶原料藥生產(chǎn)工藝分析

無菌結(jié)晶原料藥的生產(chǎn)流程包括液體和固體兩個階段，粗品溶解后經(jīng)過除菌過濾進(jìn)入結(jié)晶釜的結(jié)晶、過濾、烘干等過程為液體階段，烘干物料的分裝為固體階段。無菌工藝模擬試驗工藝應(yīng)涵蓋溶液通過除菌過濾器后至分裝結(jié)束，但不涵蓋粗品的溶解過程。

二、無菌工藝模擬試驗前的準(zhǔn)備

在無菌工藝驗證前，對其生產(chǎn)設(shè)備的設(shè)計和確定有著十分重要的意義［3］。無菌工藝模擬試驗前應(yīng)確保生產(chǎn)設(shè)施設(shè)備、公共系統(tǒng)、儀器儀表、人員等均已經(jīng)過確認(rèn)并在確認(rèn)有效期內(nèi)，并保證無菌工藝模擬試驗期間的正常運行。

(一)生產(chǎn)設(shè)施確認(rèn)。一是潔凈區(qū)高效泄露測試合格;二是層流區(qū)域煙霧測試確認(rèn)氣流流向未紊亂;三是從潔凈區(qū)消毒效果和潔凈級別應(yīng)能滿足操作要求，并確定監(jiān)控方案對環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測;四是潔凈區(qū)溫濕度滿足產(chǎn)品生產(chǎn)要求，并使人員穿著無菌衣舒適。

(二)公共系統(tǒng)確認(rèn)。一是確認(rèn)水系統(tǒng)(包括純化水系統(tǒng)和注射用水系統(tǒng))的安裝和供水質(zhì)量滿足生產(chǎn)需求;二是確認(rèn)直接接觸產(chǎn)品或無菌設(shè)備的壓縮空氣系統(tǒng)、氮氣系統(tǒng)滿足生產(chǎn)要求，包括微粒、微生物等;三是確認(rèn)純蒸汽系統(tǒng)能夠滿足生產(chǎn)需要，如設(shè)備和無菌衣的滅菌、直接接觸產(chǎn)品的包裝材料和工器具的滅菌等。

(三)設(shè)備確認(rèn)。一是確認(rèn)生產(chǎn)設(shè)備性能滿足產(chǎn)品生產(chǎn)要求;二是確認(rèn)生產(chǎn)設(shè)備材質(zhì)和設(shè)計滿足清潔要求;三是確認(rèn)生產(chǎn)設(shè)備滅菌效果能滿足要求，無滅菌死角;四是確認(rèn)設(shè)備的密閉性能滿足設(shè)計要求，并經(jīng)過泄漏測試合格。

(四)儀器儀表校驗。一是確認(rèn)儀器儀表均經(jīng)過校驗并在校驗有效期內(nèi);二是儀器儀表精度和型號滿足生產(chǎn)要求。

(五)除菌過濾器。確認(rèn)除菌過濾器效果經(jīng)過驗證，包括過濾器材質(zhì)與產(chǎn)品的兼容性，過濾效果確認(rèn)，過濾器的完整性測試等。

(六)無菌生產(chǎn)工藝。無菌生產(chǎn)工藝流程和工藝參數(shù)，各工序操作時限等均已確認(rèn)，并評估確認(rèn)最差條件。

(七)人員。一是無菌操作人員已經(jīng)過資質(zhì)確認(rèn)，包括GMP知識、微生物知識、無菌操作培訓(xùn)、無菌更衣確認(rèn)等;二是無菌操作人員數(shù)量和職責(zé)確認(rèn);三是無菌操作區(qū)域管理人員資質(zhì)和職責(zé)確認(rèn);四是QC取樣和過程監(jiān)測人員資質(zhì)和職責(zé)確認(rèn);五是QA過程監(jiān)控人員資質(zhì)和職責(zé)確認(rèn);六是維修人員資質(zhì)和職責(zé)確認(rèn)。

三、模擬介質(zhì)的選擇

為了保證無菌工藝模擬試驗結(jié)果的可信性，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)環(huán)境選擇適當(dāng)?shù)哪M介質(zhì)。模擬介質(zhì)應(yīng)具備以下要求:一是對微生物生長無抑制作用，且能夠促進(jìn)微生物生長。二是模擬介質(zhì)在培養(yǎng)基溶液中要有較好的溶解度。模擬介質(zhì)最終會與培養(yǎng)基溶液進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果通常是通過觀察培養(yǎng)基溶液的澄清度進(jìn)行判定。三是模擬介質(zhì)不能影響培養(yǎng)基溶液的促生長效果。需要對模擬介質(zhì)加入培養(yǎng)基溶液后溶液的促生長效果進(jìn)行確認(rèn)，確定其不影響培養(yǎng)基溶液的質(zhì)量。四是模擬介質(zhì)應(yīng)易于清洗，并對設(shè)備沒有腐蝕性［6］，無毒，不污染環(huán)境。每次無菌工藝模擬試驗后均應(yīng)對設(shè)備進(jìn)行徹底清洗，并確認(rèn)清洗效果。

四、培養(yǎng)基的選擇

(一)培養(yǎng)基種類選擇。通常應(yīng)根據(jù)微生物種類選擇培養(yǎng)基。若工藝中存在厭氧菌，可選擇硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基。但通常產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝與空氣接觸，適合大多數(shù)微生物的生長，污染厭氧菌的幾率較小。試驗用培養(yǎng)基應(yīng)能夠支持較寬的微生物生長的菌譜，能促進(jìn)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、酵母菌和霉菌的生長。通常選擇常用的TSB(Tryptic Soy Broth大豆胰蛋白培養(yǎng)基)作為模擬試驗用培養(yǎng)基。

(二)培養(yǎng)基濃度選擇。作為培養(yǎng)的TSB培養(yǎng)基溶液通常選擇常用的微生物檢測濃度，如3%TSB培養(yǎng)基溶液，以保證培養(yǎng)基溶液的促生長效果。若選擇其他濃度，需要確認(rèn)在該濃度下培養(yǎng)基的溶解性以及對微生物的促生長能力的影響。

五、模擬介質(zhì)的滅菌

模擬介質(zhì)若本身受到污染或滅菌不徹底，會導(dǎo)致無菌工藝模擬試驗呈現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此，要確保模擬介質(zhì)的無菌性。在進(jìn)行無菌工藝模擬試驗之前，需要對模擬介質(zhì)進(jìn)行取樣檢測其無菌性。

(一)無菌工藝液體階段模擬介質(zhì)的除菌。無菌工藝液體階段模擬介質(zhì)可采用除菌過濾器進(jìn)行除菌，過濾器的選擇可根據(jù)模擬介質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行調(diào)整。若無菌工藝使用的是疏水性過濾器，而模擬介質(zhì)溶液為水溶液，可將無菌工藝使用的疏水性過濾器更換為適合模擬介質(zhì)溶液的親水性過濾器。過濾器的除菌能力不需要通過無菌工藝模擬試驗進(jìn)行驗證，因為過濾器的除菌能力已經(jīng)通過挑戰(zhàn)性試驗確認(rèn)，且其滅菌條件也經(jīng)過了滅菌工藝驗證。

(二)無菌工藝固體階段模擬介質(zhì)的滅菌。無菌固體滅菌方法很多，包括伽馬射線滅菌、濕熱滅菌等等。無論采用何種滅菌方法，都需要對滅菌效果進(jìn)行確認(rèn)，以保證模擬介質(zhì)的無菌性。也可采用市售的無菌模擬介質(zhì)固體，但該模擬介質(zhì)供應(yīng)商應(yīng)經(jīng)過資質(zhì)確認(rèn)，確保其提供模擬介質(zhì)的無菌性。

六、培養(yǎng)基的滅菌

培養(yǎng)基的滅菌同模擬介質(zhì)一樣，若企業(yè)自行滅菌，均需要對滅菌工藝進(jìn)行驗證。對于滅菌后的培養(yǎng)基溶液，均需要進(jìn)行促生長試驗。促生長試驗可采用接種枯草芽孢桿菌和白色念珠菌，接種量均少于100CFU，在20～25度培養(yǎng)3天，再在30～35度培養(yǎng)2天，各管培養(yǎng)基中接種微生物均應(yīng)明顯生長。

七、無菌工藝模擬試驗工藝的設(shè)計

無菌工藝模擬試驗工藝設(shè)計應(yīng)綜合考慮生產(chǎn)線可能發(fā)生污染的各種因素［4］，并避免不利于微生物生產(chǎn)的因素。模擬試驗過程參數(shù)的選擇如下:

(一)溫度。無菌原料藥結(jié)晶工藝通常包括升溫和降溫過程，考慮對微生物的生長影響，建議在整個模擬過程采用易于微生物生產(chǎn)的溫度，如25～30℃，避免高溫或低溫等影響微生物生長的環(huán)境。在溶解階段，考慮模擬介質(zhì)的溶解速度，可采用加溫的方式加快模擬介質(zhì)的溶解速度，但在壓濾進(jìn)入結(jié)晶釜前，應(yīng)將溶液降溫至適當(dāng)?shù)臏囟?25～35℃)，以確保溶液溫度不影響無菌段可能的微生物的生長。

(二)壓力。對于抽真空工藝，考慮微生物在缺氧情況下影響其生長的因素，因此可采用模擬抽真空的動作，即抽真空至需要的真空度后，保持一定時間后，進(jìn)行破真空，使設(shè)備內(nèi)達(dá)到常壓，確定抽真空操作對無菌生產(chǎn)的影響。抽真空的次數(shù)根據(jù)工藝要求而定，通常不少于工藝要求次數(shù)。對于加壓操作，若工藝采用壓縮空氣進(jìn)行加壓，可模擬工藝過程;若工藝采用潔凈氮氣進(jìn)行加壓，則需要將氮氣更換為壓縮空氣。氮氣通常通過氣體除菌過濾器進(jìn)入設(shè)備，替代的壓縮空氣也要通過相同的氣體除菌過濾器進(jìn)入設(shè)備，以保證氣體除菌過濾器后的氣體管道也被覆蓋到。

(三)過程取樣和加料操作。根據(jù)生產(chǎn)要求，在生產(chǎn)過程中的取樣操作必須在無菌工藝模擬試驗中進(jìn)行模擬。即采用與生產(chǎn)相同的操作進(jìn)行取樣。取樣獲得的樣品不能丟棄，需要保留進(jìn)行無菌檢查。若生產(chǎn)過程中存在加料操作，可采用模擬介質(zhì)代替晶種，模擬加晶種的操作，以確認(rèn)該操作不會影響產(chǎn)品的無菌性。

(四)操作時限。無菌工藝模擬試驗必須達(dá)到或超過產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的最長條件。如結(jié)晶時間、過濾時間、干燥時間、分裝時間、無菌包裝材料的存放時間等，尤其是產(chǎn)品暴露在環(huán)境中的時間。這些在設(shè)計無菌工藝模擬參數(shù)時必須進(jìn)行考慮。

(五)模擬介質(zhì)的數(shù)量。模擬介質(zhì)的數(shù)量應(yīng)考慮對設(shè)備表面的全覆蓋，至少大于產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的數(shù)量。

(六)其他參數(shù)的選擇。對于參數(shù)的選擇原則是不影響微生物的生長，并能夠模擬生產(chǎn)過程中可能存在無菌風(fēng)險的操作。如結(jié)晶過程中的攪拌操作，攪拌速度過快對微生物操作有影響，且其可能存在無菌風(fēng)險，因此在模擬時，應(yīng)確定攪拌速度，若生產(chǎn)時要求攪拌速度較快，可在模擬時攪拌較短時間后，降低攪拌速度，或間歇攪拌。若溶解結(jié)晶采用的是有機溶劑，考慮有機溶劑對微生物生長的影響，可將有機溶劑調(diào)整為水溶液。

八、干涉活動及樣品取樣

無菌工藝模擬試驗必須考慮生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)的非正常操作，如抽真空的真空泵突然停止、分裝過程中包裝容器翻倒、分裝數(shù)量調(diào)整等。這些非正常操作可通過實際操作進(jìn)行積累，在定期的無菌工藝模擬試驗中進(jìn)行模擬。模擬的次數(shù)根據(jù)實際發(fā)生概率而定。每次模擬涉及的樣品根據(jù)需要進(jìn)行取樣標(biāo)識，評估其對無菌操作的影響。如分裝過程中出現(xiàn)容器側(cè)翻，認(rèn)為調(diào)整后進(jìn)行分裝，若該包裝最終污染，且確認(rèn)為該操作引起的，在實際生產(chǎn)中發(fā)生該操作，則需要采用其他方式處理，如丟棄該包裝容器。

九、環(huán)境監(jiān)測

為確保無菌工藝模擬試驗的可靠性，在模擬試驗過程中需要對環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測，包括潔凈區(qū)懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、設(shè)備表面菌、人員表面菌。對潔凈區(qū)的環(huán)境監(jiān)測不應(yīng)少于日常的環(huán)境監(jiān)測，尤其是對無菌區(qū)域的監(jiān)測，需要考慮環(huán)境取樣對無菌操作的影響。無菌工藝模擬試驗應(yīng)盡可能在惡劣的環(huán)境下進(jìn)行，通過將操作人數(shù)增加到最大來達(dá)到此目的。在環(huán)境監(jiān)測過程中，所有產(chǎn)品暴露操作的環(huán)境都需要進(jìn)行監(jiān)控。［5］

十、樣品培養(yǎng)和結(jié)果檢查

樣品的培養(yǎng)要求對樣品進(jìn)行全培養(yǎng)，不能隨意丟棄樣品，除非樣品明顯被污染，且污染的原因很明確。

(一)液體階段樣品。采用液體介質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)時，若溶液量較小，可采用將所有溶液分裝并加入無菌培養(yǎng)基的方式進(jìn)行培養(yǎng)。但通常的商業(yè)化生產(chǎn)中，溶液量均較大，將溶液分裝并加入培養(yǎng)基的過程中，很難不對溶液造成污染，造成假陽性試驗?？蓞⒄諢o菌檢查的方式，采用除菌過濾器對溶液進(jìn)行全過濾后，對除菌過濾器進(jìn)行培養(yǎng)。除菌過濾器至少采用0．45um級除菌過濾器。過濾結(jié)束后，將除菌過濾器在無菌環(huán)境下進(jìn)行外表面消毒，將過濾器內(nèi)殘留溶液放入無菌容器，過濾器也取出放置在無菌容器中，加入預(yù)先滅菌的培養(yǎng)基溶液，密封后進(jìn)行培養(yǎng)。

(二)固體階段樣品。固體階段采用固體模擬介質(zhì)模擬分裝過程，將模擬介質(zhì)分裝如包裝容器后加入預(yù)先準(zhǔn)備的滅菌后培養(yǎng)基溶液，密封振搖后，進(jìn)行培養(yǎng)。加入培養(yǎng)基溶液后，其量至少是容器裝量的2/3，在培養(yǎng)過程中翻轉(zhuǎn)容器即可保證對容器的全覆蓋。應(yīng)取2件進(jìn)行陽性試驗，確認(rèn)在該條件下微生物能夠生長。

(三)樣品培養(yǎng)結(jié)果檢查。無菌工藝模擬試驗樣品需進(jìn)行全培養(yǎng)，培養(yǎng)條件應(yīng)與無菌檢驗條件相同，即先在較低溫度(20～25℃)下培養(yǎng)7天，然后在較高溫度(30～35℃)下培養(yǎng)7天?？紤]從較低溫度到較高溫度的升溫過程，可適當(dāng)延長較高溫度的培養(yǎng)時間。

對于液體階段的過濾器，可先將過濾器振搖、翻轉(zhuǎn)，聞培養(yǎng)基的氣味是否為培養(yǎng)基特有的淡淡的氣味;如果長菌，會有有別于無菌培養(yǎng)基的臭味。觀察培養(yǎng)基溶液外觀是否為黃色清亮透明;如果長菌，黃色會變淺，溶液渾濁、不透明。如果長霉菌，培養(yǎng)基溶液會澄清，溶液內(nèi)會漂浮著朵狀霉菌菌落。取出過濾器，再用手電筒照射檢查過濾器殼內(nèi)是否有遺漏的菌斑。每支濾芯外表面用“菌落計數(shù)器”仔細(xì)照射檢查。濾芯內(nèi)表面用手電筒照射檢查。無菌的濾芯濾紙表面應(yīng)略有發(fā)黃，顏色淺，色澤均勻。長菌的濾芯會有菌斑，發(fā)黑，呈點狀，不均勻的。

對于固體階段的培養(yǎng)容器，可將容器振搖、翻轉(zhuǎn)，打開后，將培養(yǎng)基溶液倒入到無菌透明PE袋內(nèi)。立即觀察外觀性狀。再用手電筒照射檢查鋁聽、膠塞內(nèi)表面是否有遺漏的菌斑。

(四)培養(yǎng)結(jié)果判定。若發(fā)現(xiàn)污染應(yīng)對微生物污染的樣品進(jìn)行鑒別試驗，鑒別的內(nèi)容至少應(yīng)包括菌落、細(xì)胞形態(tài)學(xué)及革蘭染色特性等。

(五)試驗樣品培養(yǎng)基促生長試驗。對于樣品的檢查應(yīng)在無菌環(huán)境下進(jìn)行，在液體階段和固體階段培養(yǎng)樣品合格的情況下，還需要對培養(yǎng)后的培養(yǎng)基取樣進(jìn)行微生物促生長試驗，以確定培養(yǎng)基的促生長能力，以免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

十一、無菌工藝模擬試驗結(jié)果評價

(一)合格結(jié)果判定。一是批生產(chǎn)操作涵蓋模擬設(shè)計中列出的最差條件;二是培養(yǎng)基促生長試驗合格;三是過程樣品檢查符合檢測要求;四是所有培養(yǎng)產(chǎn)品無污染;五是環(huán)境監(jiān)測合格。

(二)失敗結(jié)果調(diào)查。若試驗有污染，應(yīng)調(diào)查:一是生產(chǎn)環(huán)境微生物監(jiān)測數(shù)據(jù);二是生產(chǎn)環(huán)境懸浮粒子監(jiān)測數(shù)據(jù);三是人員污染的監(jiān)測數(shù)據(jù);四是HEPA過濾器的完整性檢測、粒子、風(fēng)速等;五是操作間的空氣流向、壓差;六是操作人員的操作方法、培訓(xùn)情況;七是模擬試驗過程中的異常情況;八是無菌室生產(chǎn)工具及其他用品的儲存狀況;九是鑒別污染微生物的種、屬，以尋找污染源的線索;十是無菌室的清潔、清潔堆規(guī)程的培訓(xùn)及執(zhí)行情況;十一是無菌生產(chǎn)用設(shè)備的控制系統(tǒng)和監(jiān)測系統(tǒng)的校正;十二是生產(chǎn)前、生產(chǎn)后過濾器的完整性檢測結(jié)果;十三是相關(guān)產(chǎn)品、相關(guān)生產(chǎn)過程存在的問題等。

原因調(diào)查結(jié)束后，應(yīng)根據(jù)調(diào)查所確定的或可能發(fā)生的原因制定糾正或改進(jìn)方案并予以實施，并評估對已經(jīng)生產(chǎn)產(chǎn)品無菌性的影響。當(dāng)改進(jìn)方案實施之后應(yīng)重復(fù)模擬試驗。

十二、無菌工藝模擬試驗方案和報告

無菌工藝模擬試驗應(yīng)制定方案，并在實施后形成報告，內(nèi)容至少包括以上內(nèi)容。在無菌工藝模擬試驗后，還需要進(jìn)行清潔效果確認(rèn)，以保證模擬試驗介質(zhì)不會污染生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境。

［1］國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證中心．藥品GMP指南·無菌藥品［M］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2011，8:1

［2］翟鐵偉．無菌原料藥的無菌工藝驗證［J］．醫(yī)藥工業(yè)設(shè)計雜志，2004，25(4):31 ～34

［3］張鳳．無菌原料藥的無菌工藝驗證［J］．科技創(chuàng)業(yè)家，2014，4(下):216

［4］李妮，劉智勇．新版GMP中對無菌工藝驗證要求的探討［J］．設(shè)備驗證與 GMP，2011，12(12):20 ～24

［5］薛紅霞，劉敏，林?。疅o菌原料藥的無菌工藝驗證［J］．河北企業(yè)，2013，7:133 ～134

［6］梁書臣，張素霞，劉樹林等．無菌原料藥的無菌工藝驗證探討［J］．工藝探討與系統(tǒng)設(shè)計，2009，1(1):44～48

［7］梁毅，賀聰．無菌原料藥生產(chǎn)工藝驗證過程的研究［J］．中國藥房，2012，23(41):3849 ～3852

［8］美國FDA-無菌工藝生產(chǎn)無菌產(chǎn)品工業(yè)指南-cGMP(2004-9)

［9］PDA_TR No．28:Process Simulation Testing for Sterile Bulk Pharmaceutical Chemicals，2006

［10］PDA_TR No．22:Process Simulation for Aseptically Filled Products，2011