門 鵬 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)是一種α-皰疹病毒，可引起牛、羊、貓、馬等家畜和多種野生動物產(chǎn)生以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為特征的急性致死性傳染病。豬是PRV的自然宿主和貯存宿主，感染后可引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒和死胎，對新生的仔豬常引起神經(jīng)癥狀或腹瀉，并大批死亡，病死率甚至高達(dá)100%[1,2]。因此，偽狂犬病是養(yǎng)豬業(yè)的一種重要繁殖障礙性傳染病給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[3,4]。動物感染該病毒后可以終生帶毒，呈現(xiàn)潛伏感染的特征，但在應(yīng)激因子的刺激下潛伏感染的病毒基因組被激活，重新產(chǎn)生感染性病毒粒子，導(dǎo)致動物發(fā)病，并傳播給其它動物。疫苗免疫只能阻止豬發(fā)病和出現(xiàn)臨床癥狀，但不能控制PRV的潛伏感染與重新激活。

PRV具有典型的皰疹病毒的病毒粒子結(jié)構(gòu)，病毒粒子直徑約為110～150nm，位于胞漿內(nèi)帶囊膜的成熟病毒粒子的直徑約150～180nm[5]。成熟的病毒粒子分四層，最外層是由宿主細(xì)胞衍生而來的脂質(zhì)雙層囊膜，囊膜上鑲嵌著病毒編碼的蛋白，多為糖蛋白，是動物機(jī)體免疫系統(tǒng)識別的主要靶抗原；病毒囊膜里面是一層非晶體狀蛋白樣結(jié)構(gòu)；第三層結(jié)構(gòu)為由162個殼粒組成的衣殼，是一個等24面體；最中心的是核酸蛋白核心，它含有線狀雙鏈DNA的基因組，G+C含量高達(dá)73%。

PRV具有廣泛的細(xì)胞嗜性，可以在多種傳代細(xì)胞增殖并引起CPE，如BHK-21、VERO、PK-15等。通過電鏡觀察細(xì)胞培養(yǎng)的病毒粒子可以看到有部分病毒具有完整的囊膜結(jié)構(gòu)，有一部分病毒只具有核衣殼和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，因此，核衣殼蛋白可以比較全面的反應(yīng)所以病毒粒子在細(xì)胞中的情況，可以被用來作為病毒粒子的檢測標(biāo)準(zhǔn)。核衣殼蛋白VP5是穩(wěn)定的病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒粒子中占有很大比例[6]。本研究對PRV bartha疫苗株VP5基因進(jìn)行克隆，并原核表達(dá)獲得病毒VP5截短蛋白，以期為PRV的流行變異、細(xì)胞生物學(xué)研究及病原檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和試劑 豬偽狂犬病bartha活疫苗購自成都天邦生物制品有限責(zé)任公司；BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；DmEm培養(yǎng)液購自gibio，無支原體初生牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL-21感受態(tài)細(xì)胞購自大連寶生物有限公司；Axyprep DNA 凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒小題試劑盒均購自AXYGEN；瓊脂糖凝膠購自BIOWEST；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 病毒增殖 用含10%牛血清的DmEm培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層后，除去培養(yǎng)基，用PBS(pH7.2)洗單層細(xì)胞1次，接種PRV，37℃吸附1h后，加入維持液(含2%牛血清的DmEm)，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)約48h，待細(xì)胞病 變達(dá)80%以上時，反復(fù)凍融細(xì)胞3次，收獲病毒懸液，按常規(guī)方法測定其TCID50。

1.3 PRV基因組DNA提取 取反復(fù)凍融的PRV病毒液500μl于1.5ml離心管中，加入蛋白酶K 5μl，按照試劑盒說明提取病毒DNA。

1.4 VP5蛋白生物學(xué)特性分析及基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公開的偽狂犬病毒VP5基因序列，對vp5表達(dá)蛋白生物特性進(jìn)行分析。選取VP5蛋白親水區(qū)1-398位氨基酸設(shè)計引物，引物序列如下：PRV-VP5 F: 5'-ttaagaattcatggagcgcccg gccatcctgccg-3'；PRV-VP5R: 5'-taattaagcttgtacggcacctgcgtg gcctggta-3'引物中下劃線部分為酶切位點(diǎn) ：EcoR I與Hind III。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

反應(yīng)體系：5×Buffer 10μl，dNTP mixture4μl，模板1μl，ddH2O 32.5μl，DNA Polymerase0.5μl，上、下游引物各1μl，共50μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；95℃ 10s，55℃15s，72℃90s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。產(chǎn)物Axyprep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.5 VP5原核表達(dá)載體的構(gòu)建 上述膠回收所得產(chǎn)物和pET-28a載體同時用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Hind III 進(jìn)行雙酶切，分別切取VP5基因目的條帶與pET-28a載體條帶，切膠回收?；厥债a(chǎn)物連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒酶切鑒定，獲得 重組質(zhì)粒，命名為VP5-pET28。

1.6 重組VP5蛋白的表達(dá) 重組質(zhì)粒VP5-pET28轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌活化培養(yǎng)，挑取陽性克隆，接種于2ml LB培養(yǎng)液中，于37℃振蕩過夜；次日取100μl菌液，接種于2ml LB培養(yǎng)液中，于37℃振蕩培養(yǎng)3h，加入IPTG使其終濃度為1.5mmol/L，20℃誘導(dǎo)12h，取樣進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。同時收集菌體，以5ml/g濕菌的比例加入超聲緩沖液，于冰浴中超聲破菌(功率300W，超聲3s，間隔3s，共10min)。離心，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)形式。

1.7 重組蛋白的大量純化 將陽性菌株接種到1L LB培養(yǎng)基內(nèi)，按照1.6方法大量誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。收集菌體，將菌體裂解液沉淀懸于Binding Buffer(0.15m NaCl，20mm Tris-Cl，5mm咪唑，pH7.9)中，洗滌，于冰浴中超聲破菌(功率300W，超聲3s，間隔3s，共40min)。12000rpm離心30min，分別收集上清和沉淀，取上清，經(jīng)孔徑為0.45μm的濾膜過濾，并負(fù)載上Ni-Agarose His柱，用15倍柱體積的Binding Buffer 沖洗柱子，5倍柱體積的Eluting Buffer (0.15m NaCl，20mm Tris-Cl，500mm咪唑)洗脫，分步收集。取各管收集液1ml，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2h，分別加入陽性PRV血清及抗HIS單克隆抗體，4℃孵育過夜；PBST洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1:3000稀釋)，室溫作用1h；DAB顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 VP5基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 VP5基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1215bp的特異性條帶，大小與預(yù)期相符，見圖1。

圖1 VP5基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 m.DL2000 maeker;

圖2 PPE68重組表達(dá)質(zhì)粒 雙酶切產(chǎn)物的鑒定

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-VP5的PCR產(chǎn)物可見1215bp的目的基因片段，經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切，可見約5400bp的載體片段和1215bp的目的基因片段，見圖2。雙向測序結(jié)果與VP5基因編碼序列完全一致。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，誘導(dǎo)表達(dá)VP5蛋白。SDS-PAGE分析顯示，BL21/pET-28a(＋)-VP5的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物可見相對分子質(zhì)量約45KD的蛋白條帶，為上清表達(dá)。見圖3(第4泳道)。而BL21/pET-28a(＋)-VP5未加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)組及BL21/pET-28a(＋)的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物沒有明顯的表達(dá)條帶。經(jīng)膠掃描分析，目的蛋白約占菌體總蛋白的61%。融合蛋白主要以可溶性形式存在。

2.4 重組蛋白的Western blot分析 Western blot分析顯示，重組蛋白可以與PRV陽性血清及his單克隆抗體反應(yīng)，在相對分子質(zhì)量約45KD處可見特異的反應(yīng)條帶，與VP5融合蛋白預(yù)期相符(圖4)。

圖3 誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)鑒定

圖4 VP5蛋白免疫原性鑒定

3 討論

（1）PRV是一種α-皰疹病毒，可引起多種家畜和野生動物的偽狂犬病。除豬以外的其它動物表現(xiàn)為致死性感染。豬是PRV的天然宿主和貯存宿主，常呈流行性感染。成年豬表現(xiàn)為隱性感染和呼吸道癥狀，母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎，公豬表現(xiàn)為睪丸炎。仔豬表現(xiàn)發(fā)熱、昏迷和神經(jīng)癥狀，死亡率很高。PRV感染豬后可建立潛伏感染，主要潛伏在豬的神經(jīng)組織中，此時在豬體內(nèi)檢測不到病毒，但在應(yīng)激因子的刺激下潛伏感染的病毒基因組被激活，重新產(chǎn)生感染性病毒粒子，導(dǎo)致動物發(fā)病，并傳播給其它動物。（2）近年來流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國豬場偽狂犬病的感染率很高[7]。自2013年以來，偽狂犬病毒野毒在各個豬場被廣泛檢測到，造成了偽狂犬病的發(fā)生，病豬死亡率很高[8-10]。本實(shí)驗(yàn)室從不同地區(qū)分離了幾株野毒株，并進(jìn)行了基因序列分析。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了PRV核衣殼蛋白VP5截短基因重組表達(dá)質(zhì)粒，原核表達(dá)并純化了重組VP5蛋白，純化后的重組蛋白純度較 高，為偽狂犬病毒特異性診斷抗原的開發(fā)及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

[1]Se nf W, Seffner W.Experiences with Aujeszky's disease with special reference to some cases in sheep and cattle.monatshefte fur veterinarmedizin, 1966, 21:58-64.

[2]Sh ope RE.Pseudorabies as a contagious disease in swine.Science, 1934, 80:102-103.

[3]李春華, 王英, 蔣鳳英等.豬偽狂犬病研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 29:68-72.

[4]童光志, 陳煥春.偽狂犬病流行現(xiàn)狀及我國應(yīng)采取的防制措施[J].中國獸醫(yī)學(xué)報, 1999, 19:1-2.

[5]Pomeranz LE, Reynolds AE, Hengartner CJ.molecular biology of pseudorabies virus: impact onneurovirology and veterinary medicine.microbiology and molecular biology reviews, 2005, 69:462-500.

[6]向駿, 程安春, 汪銘書.皰疹病毒衣殼蛋白及其組裝研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43:22.

[7]Pedersen K, Bevins SN, Baroch JA, et al.Pseudorabies in feral swine in the United States, 2009-2012.Journal of wildlife diseases, 2013, 49:709-713.

[8]An TQ, Peng Jm, Tian ZJ, et al.Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs, China, 2012.Emerging infectious diseases, 2013, 19:1749-1755.

[9]白挨泉, 王曉清, 甄勁松等.廣東部分集約化豬場豬偽狂犬病毒野毒感染的血清學(xué)調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī), 2005, 32: 55-57.

[10]Yu X, Zhou Z, Hu D, et al.Pathogenic pseudorabies virus, China, 2012.Emerging infectious diseases, 2014, 20: 102-104.