陳恩保 劉文利 （山東省齊河縣畜牧獸醫(yī)局 251100）

由于環(huán)境中各種致病因素尤其是免疫抑制性致病因素的存在，嚴(yán)重影響了家禽機(jī)體的免疫功能和對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答效果，使得傳染性疾病的防治變得非常困難。因此，預(yù)防傳染性疾病的發(fā)生僅靠疫苗是不夠的，需要采取包括增強(qiáng)機(jī)體免疫力在內(nèi)的綜合防制手段。而免疫增強(qiáng)劑正是通過(guò)非特異性途徑來(lái)增強(qiáng)機(jī)體后天獲得的非特異性和特異性免疫機(jī)能，這可能是解決該項(xiàng)難題的一條重要途徑。為此，從益氣、補(bǔ)血、滋陰、壯陽(yáng)四個(gè)方面著手，精心篩選出硫酸修飾化黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖這四種分別具有此項(xiàng)功能的多糖組成復(fù)合制劑，以此復(fù)合制劑作為免疫增強(qiáng)劑，為了搞清這四種組分在整個(gè)組方中所起的作用以及各組分間的最佳用藥配比，筆者以T淋巴細(xì)胞ANAE陽(yáng)性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率為指標(biāo)，應(yīng)用正交試驗(yàn)法進(jìn)行了研究分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用藥物 黃芪多糖、淫羊藿多糖、當(dāng)歸多糖、枸杞多糖，全部購(gòu)自北京市藥材公司，經(jīng)含量測(cè)定分別為89.1%、73.7%、(苯酚—硫酸法)。

1.2 試驗(yàn)用雞 商品海蘭白蛋雞，10日齡健康雛雞。

1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)采用L9(34)正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)[1,2]，將硫酸修飾化黃芪多糖(A)、當(dāng)歸多糖(B)、枸杞多糖(C)及淫羊藿多糖(D)作為4個(gè)試驗(yàn)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，各因素水平詳見(jiàn)表1。

1.4 試驗(yàn)方法 按L9(34)正交表提供的配方設(shè)計(jì)9個(gè)試驗(yàn)組，另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組。具體方法是選擇11日齡、體重相近的健康雛雞100只，隨機(jī)分為10組，每組10只，1-9組分別為按L9(34)正交表提供的9個(gè)不同配方的用藥組，第10組為空白對(duì)照組即不用藥組，連用5d后，分別在16日齡和21日齡抽取各組雞5只，進(jìn)行T淋巴細(xì)胞ANAE陽(yáng)性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率試驗(yàn)。具體正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

1.5 T淋巴細(xì)胞ANAE陽(yáng)性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行檢測(cè)。

表1 因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 L9(34)正交試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果(±SD)

表2 L9(34)正交試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果(±SD)

處理號(hào) 因素 T淋巴細(xì)胞 ANAE陽(yáng)性率% B淋巴細(xì)胞 EAC花環(huán)率% A B C D 1 1 1 1 1 33.5±1.6 35.2±2.6 22.0±3.2 28.5±3.6 2 1 2 2 2 38.2±1.5 39.0±1.4 21.6±2.7 24.2±3.0 3 1 3 3 3 34.5±2.5 35.3±3.2 20.4±1.2 23.9±3.3 4 2 1 2 3 36.1±1.7 37.3±2.3 21.0±2.5 23.5±1.8 5 2 2 3 1 32.7±2.8 36.2±1.7 24.4±1.4 27.9±3.2 6 2 3 1 2 29.5±2.4 32.5±1.9 19.2±1.6 22.7±2.9 7 3 1 3 2 34.6±1.7 37.6±2.1 23.4±1.3 27.2±1.8 8 3 2 1 3 36.3±1.9 39.8±1.9 23.4±1.2 29.1±2.2 9 3 3 2 1 34.3±1.7 38.1±1.4 23.5±2.3 29.6±1.7 10 0 0 0 0 25.1±1.5 28.0±2.6 12.0±3.1 17.3±2.4

正交試驗(yàn)的結(jié)果詳見(jiàn)表2。從表2可以看出，用正交試驗(yàn)法得到的9組不同的復(fù)合中草藥提取物配方與空白對(duì)照組相比，都對(duì)T淋巴細(xì)胞ANAE陽(yáng)性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的提高有不同程度的促進(jìn)作用，兩者差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀(guān)分析 T淋巴細(xì)胞ANAE陽(yáng)性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的極差分析見(jiàn)表3。表3是分別在16日齡和21日齡時(shí)檢測(cè)的T淋巴細(xì)胞ANAE陽(yáng)性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率情況。根據(jù)所得極差R的大小順序可知，A因素和B因素對(duì)T淋巴細(xì)胞ANAE陽(yáng)性率的影響較大，D因素影響最小。

根據(jù)極差R的大小順序可知，A因素和B因素對(duì)B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的影響較大，C因素影響最小。

表3 直觀(guān)分析結(jié)果

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

表4 方差分析結(jié)果

（1）因?yàn)長(zhǎng)9(34)正交表中的4列都已經(jīng)安排因素沒(méi)有空列。因此計(jì)算誤差平均和，可用因素平方和中最小者作為誤差平方和平均變動(dòng)的估計(jì)值，但df誤必須為無(wú)窮大[4]。（2）從方差分析結(jié)果可以看出，A因素和B因素對(duì)T淋巴細(xì)胞ANAE陽(yáng)性率的影響較大，D因素影響最小。（3）A因素和D因素對(duì)B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的影響極顯著，B因素影響顯著，C因素影響最小。與極差分析的結(jié)果基本一致。

2.4 最優(yōu)配方的篩選 綜合以上結(jié)果可以得出，A因素是影響兩者大小的重要因素，B因素次之，C和D兩因素影響較差。進(jìn)一步從節(jié)約生產(chǎn)成本考慮，所以該復(fù)合中草藥提取物的最優(yōu)組合為A3B2C1D1。

3 結(jié)論與討論

（1）通過(guò)正交試驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)分析，得到該復(fù)合中草藥提取物的最優(yōu)組合為黃芪多糖(A)、當(dāng)歸多糖(B)、枸杞多糖(C)及淫羊藿多糖(D)。（2）正交試驗(yàn)是一種適用于多因素多水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可以通過(guò)全部因素或主要因素、水平的組合試驗(yàn)，找出各因素、水平間的內(nèi)在組合規(guī)律，達(dá)到與全面組合試驗(yàn)相似的效果，比較適合于制劑配方的篩選。應(yīng)用正交試驗(yàn)的方法，分析中藥復(fù)方各組分在整體組方中所起作用的大小以及各組分的最佳用藥劑量，可以避免進(jìn)行大量的拆方試驗(yàn)，從而大大縮短了中藥組方研究開(kāi)發(fā)的時(shí)間。但本方法的難點(diǎn)是怎樣將中藥復(fù)方的整體功效綜合為一個(gè)量化的指標(biāo)。（3）在家禽體內(nèi)的免疫活性細(xì)胞中，T、B的數(shù)量與機(jī)體免疫功能的高低有著非常密切的關(guān)系，兩者數(shù)量的增加反映了機(jī)體免疫力的提高，因此，T、B淋巴細(xì)胞的多少是機(jī)體全身免疫機(jī)能強(qiáng)弱的一個(gè)具體表現(xiàn)。本試驗(yàn)以T淋巴細(xì)胞ANAE陽(yáng)性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率作為整個(gè)組方的療效指標(biāo)，基本上全面概括了整個(gè)組方的作用。（4）我們從眾多中草藥中，精心篩選出硫酸修飾化黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖這四種益氣、補(bǔ)血、滋陰、壯陽(yáng)類(lèi)的中草藥提取物組成復(fù)方制劑，用此復(fù)方制劑作為免疫增強(qiáng)劑來(lái)預(yù)防IBD，彌補(bǔ)了人們通常用中藥散劑或單一中藥提取物作為免疫增強(qiáng)劑來(lái)使用的缺點(diǎn)，該提取復(fù)合物適合于家禽各種體質(zhì)，又可飲水使用，順應(yīng)當(dāng)前家禽養(yǎng)殖規(guī)?；?、集約化的發(fā)展趨勢(shì)，方便省力，可節(jié)約大量人力、物力、財(cái)力和時(shí)間。中草藥又具有別于其它類(lèi)免疫增強(qiáng)劑的獨(dú)特天然優(yōu)勢(shì)，而且它來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，用此提取復(fù)合物作為免疫增強(qiáng)劑使用，具有重要的實(shí)際意義。

[1]莫惠棟.農(nóng)業(yè)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)[m].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1994.

[2]楊進(jìn), 陳建.用正交試驗(yàn)法研制鹽酸洛美殺星滴耳劑[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2001, 20(3): 9-11.

[3]崔治中.獸醫(yī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[m].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

[4]于立芬.數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法[m].上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2005.