郭宏儒 （內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 內(nèi)蒙古 通遼 028043）

任秀珍* （內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院 內(nèi)蒙古 通遼）

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞由基因控制的有序的死亡，又稱為程序性的細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)?？沟蛲龌駼CL2家族的發(fā)現(xiàn)開辟了新一類癌基因—凋亡調(diào)控基因的新紀(jì)元[1]Bcl-2家族蛋白包括兩類功能相反的蛋白質(zhì)，一類是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL、Bclw等；另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白Bax、Bak、Bok等。Bcl-2 相關(guān)蛋白包含不同數(shù)量Bcl-2 保守區(qū)域(BH12 BH4)[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及組織

蒙古綿羊取自于內(nèi)蒙古穆斯林屠宰場。取新鮮脾臟液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 藥品與試劑

瓊脂糖、溴乙錠、總RNA提取試劑盒(Cat.NO.Z5110)購自Promega公司。反轉(zhuǎn)錄RT-PCR試劑盒(Cat.NO.DRR01 9A)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ、T4連接酶、TaKaRa ExTaq DNA Polymerase、DNA marker 為DL2000(分子量為2000、1000、750、500、250、100)、PmD18-T載體；質(zhì)粒提試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；E.coli Jm109感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)是保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成

RT-PCR引物的設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)GeneBank 反芻動(dòng)物Bcl-2和Bax的基因序列，利用計(jì)算機(jī)軟件DNAStar進(jìn)行基因序列的同源比較得出Bcl-2和Bax cDNA序列的保守區(qū)，根據(jù)該cDNA保守區(qū)和引物設(shè)計(jì)原則涉及兩對PCR引物，Bcl-2：上游引物(P1)，下游引物(P2)，Bax上游引物(P3)，下游引物(P4)引物由上海生物工程公司合成。上游引物(P1):5ˊ-TTCGCCGAGATGTCCAGTC-3ˊ，下游引物(P2):5ˊ-ATCCCAGCCTCCGTTGTCC -3ˊ，上游引物(P3): 5ˊTCCGAGTGGCGGCTGAA-3ˊ， 下 游 引 物(P4):5ˊ-GCAG ACCGTGACCATCTTT-3ˊ。

1.4 脾組織總RNA的提取

采用Promega公司的總RNA提取試劑盒，按其說明進(jìn)行。最后用無RNA酶去離子水溶解RNA沉淀，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 利用RT-PCR方法克隆Bcl-2和Bax的中間片斷

1.5.1 RT-PCR反應(yīng) Bcl-2基因cDNA第一條連的合成 如上提取蒙古綿羊脾組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組分總體系為10μl：總RNA 4.5μl，10×RT buffer 1μl，mgCl2 (25mm)2μl，dNTP mixture(10 mm)1μl，RNase Inhibiter (40U/μl)0.25μl，AmV Reverse Transcriptase Xl (5U/μl) 0.5μl，OligdT(2.5μmol/l)0.5μl，RNase Free dH2O 0.25μl，終體積10μl。反應(yīng)條件為：30℃10min，42℃ 30min，95℃5min，5℃5min，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用作PCR模版。

1.5.2 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)組分總體系為50μl：上述RT溶液10μl，5×PCR Buffer 10μl，TaKaRa ExTaq (5U/μl) 0.25μl ， P1(10pmol/μl)1μl ， P2(10pmol/μl)1μl ， dH2O 27.75μl，終體積50μl。 PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3min，94℃30s，61℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)。

1.5.3 Bax基因cDNA合成 Bax基因cDNA合成方法同Bcl-2基因。

1.5.4 bcl-2中間片斷的克隆及重組質(zhì)粒的篩選和鑒定 按PCR產(chǎn)物純化試劑盒先將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，然后用T4連接酶將純化的bcl-2基因cDNA片斷與PmD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Jm109 感受態(tài)細(xì)胞后，在含X-gal、IPTG的LB平板培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)14h。選擇白色菌落，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)Hind Ⅲ和Xba I對質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。

1.5.5 BAX中間片斷的克隆及重組質(zhì)粒的篩選和鑒定 具體操作步驟同1.5.4。

2 RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果

2.1 Bcl-2、Bax基因表達(dá)

對蒙古綿羊Bcl-2和Bax進(jìn)行表達(dá)檢測，根據(jù)對設(shè)計(jì)的引物，以脾組織的總RNA為模版，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，將純化產(chǎn)物直接送上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA序列測定，其中Bcl-2長160bp，Bax長134bp，經(jīng)過網(wǎng)上NCBI BLAST序列比對，證明確實(shí)是Bcl-2(圖1)和Bax(圖2)基因表達(dá)。

圖1 m.DL2000 DNA marker 1.Bcl-2 cDNA RT-PCR 產(chǎn)物的瓊 脂糖凝膠電泳

圖2 Bax cDNA RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 Bcl-2、Bax基因中間片斷的克隆及重組質(zhì)粒的篩選和鑒定

對RT-PCR 反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物與pmD18-T Vector 載體(2962bp)連接后獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindⅢ分別酶切鑒定，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳(90V，1.0h)檢測，得到一個(gè)約160bp和134bp的片斷，與預(yù)期的片段大小相符，證明已插入PmD18-T載體，并命名為重組載體PmD18-T- Bcl-2(見圖3)和PmD18-T- Bax(見圖4)。

圖3 重組質(zhì)粒PmD18-T- bcl-2 限制性酶切分析

圖4 重組質(zhì)粒PmD18-T-Bax 限制性酶切分析

2.3 bcl-2序列分析

通過RT-PCR擴(kuò)增出160bp部分基因序列。TTCGCCG AGATGTCCCGTCAGCTGCACCGGAAAGCCGTTACGC GAGAGAGCTTCGCCACGGTGGTGGAGGAGCTCTTCA GGGACGGGGTGAACTGGGGGCGCATCGTGGCCTTCT TTGAGTTCGGAGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCA ACCGGGAGA。

2.4 Bax序列分析

通過RT-PCR擴(kuò)增出134bp部分Bax基因序列。TCCGA GTGGCGGCTGAAATGTTTTCCGACGGCAACTTCAAC TGGGGCCGGGTTGTCGCCCTTTTCTACTTTGCCAGCA AACTGGTGCTCAAGGCCCTGTGCACCAAGGTGCCCG AGTTGATCAGGACCATCATG。

3 結(jié)論

Bcl-2是一個(gè)多基因家族，形成同源或異源二聚體，調(diào)控蛋白酶和核酸酶活性，雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。其中促進(jìn)凋亡的有Bcl-Xs、Bad、Bak、Bax等，抑制凋亡的有Bcl-2、Bcl-XL、Bcg-l等[3]。本研究通過RT-PCR技術(shù)，成功地?cái)U(kuò)增獲得了綿羊Bcl-2 基因的cDNA 序列長度為160bp，得到的Bax基因序列長度為134bp，這與Oltavai Z.N所發(fā)現(xiàn)的Bax基因的外顯子4相同。隨著對Bcl-2基因序列的測定以及凋亡本身研究的日漸深入，有利于對研究該基因在各種動(dòng)物上的分子調(diào)控機(jī)制。Bcl-2是作用機(jī)制和凋亡的分子機(jī)制最終被闡明，從而提高對與凋亡有關(guān)的疾病的認(rèn)識和診治水平。

[1]Korsmeyer S J.BCl-2 initiate a new category of oncogenes :r egulators of cell death.Blood , 1992 , 80 (4) : 879-886

[2]Brown R.British medical Bulletin, 1996；53:466-477

[3]Jimenez G S ,Khan SH ,Stommel J m ,et al.P53 regulation by post- translational modification and nuclear retention in response to diverse stresses[J].Oncogene ,1999 ,18 :76561