陳 琛 王發(fā)秀② 張賽樂 閆茂倉 *③ 柴雪良 於俊琦 謝起浪

（①浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室 浙江 溫州 325005 ②溫州醫(yī)科大學(xué)生命科技學(xué)院 浙江 溫州 ③寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江 寧波）

中草藥具有天然、高效、毒副作用小、抗藥性不顯著、資源豐富以及性能多樣等優(yōu)點，不但能直接抑菌還能提高水產(chǎn)動物的抗病力，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。目前多見中草藥防治魚類疾病的研究報道，而關(guān)于中草藥防治南美白對蝦致病菌的應(yīng)用報道還不多[11]。本研究采用體外抑菌法從23味中草藥中篩選抑制南美白對蝦致病弧菌的中草藥，旨在為中草藥在防治南美白對蝦弧菌病中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中草藥 試驗用的23種中草藥為艾葉、白術(shù)、黃連、牡丹皮、甘草、訶子、烏梅、五倍子、魚腥草、黃柏、肉蓯蓉、茯苓、連翹、大黃、金銀花、豬苓、板藍根、黃芪、杜仲、貫眾、黃芩、柴胡和山豆根，均購自浙江省溫州市中醫(yī)院。

1.1.2 致病弧菌 4種南美白對蝦致病菌菌株由本實驗室分離保存。分別是DX1203(副溶血弧菌)、DX1304(哈氏弧菌)、DX0901(鰻弧菌)和DX0801(需鈉弧菌)。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備 稱取艾葉等23味中草藥各25g，切細研磨，加250mL蒸餾水，煮沸30min,過濾，藥渣再加水250ml，煮沸30min，過濾，合并2次濾液，加熱蒸發(fā)濃縮至25ml，使生藥含量為1g/ml。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 將冷藏的四種弧菌(與牛奶混合冷凍)取部分于ZOBELL2216E液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24h，移取200μl 加 入ZOBELL2216E 液 體 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng)28℃培 養(yǎng)24h，用液體培養(yǎng)基作1:100倍稀釋后備用，供試菌液濃度在1×106CFU/ml。

1.2.3 最小抑菌濃度(mIC)的測定 首先配置ZOBELL液體培養(yǎng)基，然后每味中草藥組取150×15mm無菌試管10支，并另取2管做陰陽對照，每支試管加入10ml液體培養(yǎng)基。以10ml移液槍移取已制備好的藥液5ml加入第一管中，混勻后吸取5ml加入第二管中，依次倍比稀釋至第10管，棄去5ml。重復(fù)上述操作做為觀察對照組。118℃滅菌15min。1～10管以及陽性對照管加入菌液100μl，混勻，28℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，對照組和陰性對照管不加菌，凡是與對照組比較藥物最高稀釋廣眾清澈透明、無細菌生長者，該管的濃度即為該菌mIC。

1.2.4 最小殺菌濃度(mBC)的測定 在mIC實驗基礎(chǔ)上，從無明顯細菌生長的各管取材，分別分別涂布于相應(yīng)的TCBS平板培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。瓊脂平板上無細菌生長且含藥液最少的一管的藥液濃度，即為該種藥物對該菌的mBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 23種中草藥對副溶血弧菌DX1203的抑菌效果

23味中草藥對副溶血弧菌DX1203的抑菌效果如表1所示。各組中草藥均有一定的抑菌效果，以相同量的藥物提取液進行抑菌試驗，抑菌效果強弱不同；其中五倍子，訶子，黃芩和大黃抑菌效果最好，mIC分別為0.06、0.036、0.98和0.98mg/ml；mBC也以這四味最低，分別為0.12、0.24、0.98和1.95mg/ml。烏梅、艾葉、連翹、黃連、牡丹皮和金銀花等也表現(xiàn)出了較高的抑菌和殺菌能力，但濃度稍高于上述四味中草藥，抑菌濃度為1.95～3.91mg/ml，殺菌濃度為3.91～15.63mg/ml。

表1 23味中草藥對副溶血弧菌DX1203的mIC、mBC (mg/ml)

2.2 23種中草藥對哈氏弧菌DX1304的抑菌效果

23味中草藥對哈氏弧菌DX1304的抑菌效果如表2所示。各組中草藥均有一定的抑菌效果，以相同量的藥物提取液進行抑菌試驗，抑菌效果強弱不同；其中五倍子，訶子，黃芩和大黃抑菌效果最好，mIC 分別為0.001、0.03、0.49和0.24mg/ml；mBC也以這四味最低，分別為0.008、0.24、0.98和0.98mg/ml。烏梅、艾葉、連翹、黃連、牡丹皮和金銀花等也表現(xiàn)出了較高的抑菌和殺菌能力，但濃度稍高于上述四味中草藥，抑菌濃度為1.95～7.81mg/ml，殺菌濃度為1.95～62.50mg/ml。

表2 23味中草藥對哈氏弧菌DX1304的mIC、mBC (mg/ml)

2.3 23種中草藥對鰻弧菌DX0901的抑菌效果

23味中草藥對鰻弧菌DX0901的抑菌效果如表3所示。各組中草藥均有一定的抑菌效果，以相同量的藥物提取液進行抑菌試驗，抑菌效果強弱不同；其中五倍子，訶子，黃芩和大黃抑菌效果最好，mIC分別為0.24、0.49、0.98和1.95mg/ml；mBC也以這四味最低，分別為0.24、0.49、0.98和1.95mg/ml。烏梅、艾葉、連翹、黃連、牡丹皮和等也表現(xiàn)出了較高的抑菌和殺菌能力，但濃度稍高于上述四味中草藥，抑菌濃度為3.91～7.81mg/ml，殺菌濃度為1.95～7.81mg/ml。

表3 23味中草藥對鰻弧菌DX0901的mIC、mBC (mg/ml)

2.4 23種中草藥對需鈉弧菌DX0801的抑菌效果

23味中草藥對需鈉弧菌DX0801的抑菌效果如表4所示。各組中草藥均有一定的抑菌效果，以相同量的藥物提取液進行抑菌試驗，抑菌效果強弱不同；其中五倍子，訶子，黃芩和大黃抑菌效果最好，mIC 分別為0.001、0.004、0.49和1.95mg/ml；mBC也以這四味最低，分別為0.015、0.49、0.98和3.91mg/ml。烏梅、艾葉、連翹、黃連、牡丹皮、金銀花、柴胡、貫眾和黃芪等也表現(xiàn)出了較高的抑菌和殺菌能力，但濃度稍高于上述四味中草藥，抑菌濃度為1.95～7.81mg/ml，殺菌濃度為1.95～ 7.81mg/ml。

表4 23味中草藥對鈉需弧菌DX0801的mIC、mBC (mg/ml)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在試驗條件相同的情況下，五倍子、訶子、黃芩和大黃對凡納濱對蝦哈氏弧菌、副溶血弧菌、鰻弧菌和需鈉弧菌等幾種致病弧菌表現(xiàn)出較強的抑菌效果，說明這些中草藥中含有可以抑制甚至殺滅弧菌的有效成分。因此采用中草藥來預(yù)防上述幾種致病弧菌引起的凡納濱對蝦細菌性疾病是確實可行的。其中以五倍子的抑菌效果最佳，表明五倍子是23味中草藥中最佳的用于防治南美白對蝦弧菌病的藥物。4種致病菌中需鈉弧菌的藥物敏感性最好，藥物抑菌濃度最低。從抑菌效果可以看出，各組藥物提取液對弧菌的抑菌效果差別較大，這與各組藥物的成分組成和含量不同有關(guān)。中草藥具有廉價、來源廣、低毒、副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性等特點，且藥中某些成分既有抗菌作用，又有免疫作用，能改善機體的免疫狀態(tài)，提高自身抗菌能力。本研究為進行中草藥提升免疫力、篩選出具有研究應(yīng)用價值的中草藥提供了基礎(chǔ)。

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