劉 奇，臧曉南，張學(xué)成

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

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研究簡報

鈍頂節(jié)旋藻高產(chǎn)藻株的誘變選育*

劉 奇，臧曉南，張學(xué)成**

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

本文運用亞硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)誘變，并結(jié)合乙酰輔酶A羧化酶抑制劑喹禾靈篩選，獲得了2株能夠穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)鈍頂節(jié)旋藻突變株623-8和623-16。與鈍頂節(jié)旋藻出發(fā)株623相比，突變株的藻絲更長，更易聚集成團。在pH=8.5、光照強度45μmol·m-2·s-1和培養(yǎng)溫度28℃的條件下，突變株623-8和623-16的生物量分別比出發(fā)株提高67.86%和46.43%。蛋白含量分別比出發(fā)株623提高1.98%和0.84%；脂類含量提高8.54%和4.88%；乙酰輔酶A羧化酶活性提高31.82%和11.36%。研究結(jié)果表明，以亞硝基胍誘變結(jié)合喹禾靈篩選，可篩選出生長速度快、蛋白含量高等性狀優(yōu)良的鈍頂節(jié)旋藻藻株，在工業(yè)生產(chǎn)中有實用意義。

鈍頂節(jié)旋藻；亞硝基胍；誘變；喹禾靈

鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospiraplatensis)屬于藍藻門(Cyanophyta)、藍藻綱(Cyanophyceae)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillaoriales)。藻體為多細胞排列而成的絲狀體，彎曲呈螺旋狀，無分支。節(jié)旋藻的蛋白質(zhì)含量高達60%～72%，還含有多種維生素、氨基酸和礦物質(zhì)[1]，有很好的提高免疫力[2]、抗腫瘤[3-4]、抗輻射[5]和抗病毒[6]的功能，被世界糧農(nóng)組織譽為21世紀人類最理想的食品[7]。節(jié)旋藻于1980年代初引入中國，經(jīng)過30多年的發(fā)展，節(jié)旋藻養(yǎng)殖及相關(guān)產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國最大的微藻生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)群[8]。

從1960年代以來，因商業(yè)化的需要，人們通過自然篩選與誘變育種，選育出一系列生長迅速，蛋白含量高，抗逆性強的節(jié)旋藻藻株。誘變育種可以在短時間內(nèi)獲得優(yōu)良突變體作為新品種直接利用或作為種質(zhì)資源間接利用，具有自然篩選難以替代的優(yōu)點[9]。李建宏等采用紫外誘變的方法篩選獲得了2株性狀優(yōu)良且穩(wěn)定的鈍頂螺旋藻突變株，與出發(fā)株相比，突變株的生長速度和光合放氧速率均有顯著提高，藻藍蛋白含量提高20.2%[10]。Lanfaloni等用紫外線和亞硝基胍誘變鈍頂節(jié)旋藻，獲得抗8-氮鳥嘌呤或抗β-(2-噻嗯基)-DL氨基丙酸的抗性突變株，并從紫外線誘變處理藻株中分離得到氯酸鹽抗性突變株[11]。趙萌萌等用不同劑量的He-Ne激光照射鈍頂螺旋藻，與出發(fā)藻株相比，突變藻體在形態(tài)、干重、蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素和胞外多糖等方面都有不同程度的變化，其中β-胡蘿卜素含量增幅18.1%[12]。趙炎生等利用倍頻Nd:YAG激光誘變鈍頂螺旋藻，選出光合作用較強的藻株，其藻體蛋白質(zhì)含量增加12%，胞外多糖分泌量提高24.6%[13]。汪志平等用甲基磺酸乙酯(EMS)和60Co-γ射線處理鈍頂螺旋藻的單細胞或原生質(zhì)球，得到了4株多糖含量分別比出發(fā)品系高32.8%、17.3%、23.4%和42.3%的形態(tài)突變體[14]。張學(xué)成等用甲基磺酸乙酯誘變處理鈍頂節(jié)旋藻，篩選得到2株耐低溫的藻株[15]。韓嵐等用紫外誘變極大節(jié)旋藻，獲得2株耐低溫品種，突變株的胡蘿卜素和不飽和脂肪酸的含量也比出發(fā)藻株明顯提高[16]。

本實驗采用亞硝基胍(1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin,NTG)作為誘變劑，以除草劑喹禾靈(Quizalofop-Ethyl)作為篩選壓力對鈍頂節(jié)旋藻進行選育。對出發(fā)株和突變株形態(tài)特征、生長速度、蛋白含量、油脂含量和乙酰輔酶A羧化酶酶活性進行比較，并對pH、光照和溫度等培養(yǎng)條件進行探索。為工業(yè)生產(chǎn)提供高品質(zhì)的鈍頂節(jié)旋藻藻種提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藻種及其培養(yǎng)

本實驗選用的出發(fā)藻株為青島黃島養(yǎng)殖廠篩選出的鈍頂節(jié)旋藻藻株(Arthrospiraplatensis)，編號623，具有生長迅速，上浮性好的特點，但藻絲短，不易聚集成團，不易采收。培養(yǎng)條件為溫度24℃，光照強度為45μmol·m-2·s-1，光暗周期為12h:12h，Zarrouk培養(yǎng)基[17]，每3d將原藻液和新鮮Zarrouk培養(yǎng)基按照1:1的比例混合，對藻種進行活化，活化3次后進行后續(xù)實驗。

1.2 試劑

亞硝基胍(NTG)母液 0.8g亞硝基胍(TCI公司產(chǎn)品)溶于8mL丙酮，然后加72mL pH6.0磷酸緩沖液，終濃度為10g/L。

喹禾靈(Quizalofop-Ethyl)母液 10mg喹禾靈(SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品)溶于加入助溶劑的蒸餾水中，終濃度為10g/L。

1.3 方法

1.3.1 吸光度-生物量關(guān)系的確定 取活化的藻液按OD560=0.1接種于新鮮Zarrouk培養(yǎng)基中連續(xù)進行培養(yǎng)，2d測1次OD560并取150mL藻液過濾，冷凍干燥后稱重，以O(shè)D560對生物量關(guān)系作圖，確定吸光度與生物量(g/L)之間的關(guān)系。

1.3.2 亞硝基胍誘變預(yù)實驗 將亞硝基胍母液加入pH=6.0磷酸緩沖液至終濃度為0.05g/L，處理活化后的藻體，設(shè)置處理時間梯度為0、0.5、1、1.5和2h，并設(shè)置空白對照，每組設(shè)置3個平行樣。誘變結(jié)束后用新鮮Zarrouk培養(yǎng)基沖洗藻體以除去亞硝基胍，避光培養(yǎng)24h后，取100μL藻液涂布在Zarrouk固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10d，統(tǒng)計藻落數(shù)量，計算亞硝基胍處理時間與節(jié)旋藻致死率之間的關(guān)系。

1.3.3 喹禾靈篩選預(yù)實驗 將喹禾靈母液加入未凝固的Zarrouk固體培養(yǎng)基中混勻，設(shè)置濃度梯度，分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L，每組設(shè)置3個平行樣，將100μL活化后的藻液涂布在設(shè)置好喹禾靈濃度梯度的Zarrouk固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10d，統(tǒng)計藻落數(shù)量，計算喹禾靈濃度與鈍頂節(jié)旋藻致死率的關(guān)系。

1.3.4 突變株篩選 依照實驗1.3.2和1.3.3的結(jié)果選擇最佳的亞硝基胍誘變條件和喹禾靈篩選濃度，連續(xù)大量進行亞硝基胍誘變和喹禾靈篩選。從平板上挑選生長狀態(tài)比較良好的藻落轉(zhuǎn)入96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，選取生長迅速的藻株進行后續(xù)實驗。

1.3.5 突變株生長曲線測定 將實驗1.3.4篩選出的優(yōu)良藻株和出發(fā)株按OD560=0.1接種于新鮮Zarrouk培養(yǎng)基中連續(xù)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24℃、光照強度45μmol·m-2·s-1、pH=8.5，每株設(shè)置3個平行樣。每2d測定OD560，以O(shè)D560對時間關(guān)系作圖，比較各個藻株生長速度的差異，篩選出1～2株生長速度最快的藻株。

使用Dual-PAM-100測量出發(fā)株和突變株在24℃、光照強度45μmol·m-2·s-1、pH=8.5的培養(yǎng)條件下，PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)并進行比較，通過分析各個藻株的潛在最大光合能力對生長曲線進行驗證。

1.3.6 出發(fā)株與突變株的形態(tài)特征觀察 根據(jù)實驗1.3.5的實驗結(jié)果，篩選出1～2株生長速度快的突變株，使用OLYMPUS BX41顯微鏡對其形態(tài)特征進行觀察，并隨機挑選50條藻絲，拍攝照片，使用顯微鏡自帶的圖像處理軟件中的標尺測量藻絲長度，螺距，螺旋直徑，螺旋數(shù)等數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計分析。

1.3.7 蛋白含量測定 出發(fā)株與篩選出的突變株每株設(shè)置3個平行樣，每個樣品取0.5g冷凍干燥后的藻粉，用凱氏定氮法測定蛋白含量[18]。

1.3.8 總脂含量測定 出發(fā)株與篩選出的突變株每株設(shè)置3個平行樣，每個樣品取0.5g冷凍干燥后的藻粉，超聲破碎后加入20mL丙酮抽提油脂，最后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法分離溶劑和油脂，測定總脂含量。

1.3.9 乙酰輔酶A羧化酶活性測定 參照盧永忠的方法[19]，每株設(shè)置3個平行樣，提取出發(fā)株與篩選出的突變株的粗酶液，與乙酰輔酶A反應(yīng)生成丙二酸單酰輔酶A，反應(yīng)相同時間后使用離心超濾的方法分離酶與產(chǎn)物，最后用丙二酸單酰輔酶A ELISA試劑盒確定丙二酸單酰輔酶A濃度，推算乙酰輔酶A羧化酶活性。

1.3.10 突變株培養(yǎng)條件優(yōu)化 選擇光照強度、溫度、pH進行單因子實驗的結(jié)果，設(shè)置光照強度梯度為70、45、30μmol·m-2·s-1；溫度梯度為24、28、32℃；pH梯度為8.5、9.5、10.5。然后對光照強度、溫度、pH和藻株進行4因素3水平正交試驗。每組設(shè)置3個平行樣，培養(yǎng)6d后測定OD560，確定藻株培養(yǎng)的最佳條件。

按照以上條件對光照強度、溫度、pH和藻株進行4因素3水平正交實驗。分別測定各組的蛋白含量、乙酰輔酶A羧化酶活性及總脂含量。分析各性狀指標與藻株間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 節(jié)旋藻培養(yǎng)液吸光度-生物量關(guān)系的確定

由圖1可知，OD560在0.100～2.000之間，節(jié)旋藻培養(yǎng)液560nm波長的吸光度與生物量呈線性關(guān)系，可以用OD560計算培養(yǎng)液中節(jié)旋藻的生物量。表達式為y=0.642 7x+0.246 2，其中y是藻體干重(g/L)，x是OD560吸光度。

圖1 節(jié)旋藻培養(yǎng)液OD560與生物量關(guān)系

2.2 亞硝基胍誘變預(yù)實驗

由圖2看出，亞硝基胍對節(jié)旋藻有明顯的劑量效應(yīng)。0.05g/L的亞硝基胍作用0.5h即達到80%致死率，超過0.5h后致死率上升趨于平緩，到2h以后節(jié)旋藻全部死亡。選擇致死率為90%為誘變條件，即在亞硝基胍濃度為0.05g/L時，誘變時間1h作為誘變的方案。

圖2 亞硝基胍誘變時間與鈍頂節(jié)旋藻致死率關(guān)系

2.3 喹禾靈篩選預(yù)實驗

由圖3可知，在含有喹禾靈的培養(yǎng)基上，節(jié)旋藻的致死率隨著喹禾靈濃度的上升而上升，1.3μmol/L時達到80%致死率，到5μmol/L時節(jié)旋藻全部死亡。選擇致死率為90%為篩選實施條件，即喹禾靈濃度為2.0μmol/L。

圖3 喹禾靈濃度與鈍頂節(jié)旋藻致死率關(guān)系

2.4 突變株篩選

經(jīng)過亞硝基胍(0.05g/L)誘變1h后在含2.0μmol/L的喹禾靈培養(yǎng)基上篩選出524株藻株，連續(xù)傳代培養(yǎng)后篩選出5株生長狀態(tài)最好的藻株進行下一步實驗。編號分別為623-8、623-16、623-21、623-23和623-24。將突變株和出發(fā)株連續(xù)培養(yǎng)10d，比較它們的生長情況，結(jié)果如圖4。篩選出的5株突變株均比出發(fā)株生長速度快，其中623-8與623-16生長速度最快，在第十天時誘變株623-8與623-16的OD560分別達到1.006±0.033和0.974±0.028，比出發(fā)株623提高31.68%和27.49%。各突變株與出發(fā)藻株623間的t-test值為0.011、0.011、0.017、0.016和0.020均小于0.05，表明與出發(fā)株相比突變株的生長速度均有提高，差異顯著。

圖4 鈍頂節(jié)旋藻突變株和出發(fā)株生長曲線

調(diào)制葉綠素?zé)晒?PAM)結(jié)果表明，突變株623-8與突變株623-16的PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率分別為0.533±0.004和0.524±0.005，均高于出發(fā)株623(0.499±0.006)的最大光能轉(zhuǎn)化效率，比出發(fā)株623分別提高6.81%和5.01%(見圖5)。突變株與出發(fā)藻株623間的t-test值為0.00054和0.00027均小于0.01，表明突變株的最大光能轉(zhuǎn)化效率與出發(fā)株相比差異非常顯著。

圖5 鈍頂節(jié)旋藻623及其突變株623-8和623-16的最大光能轉(zhuǎn)化效率

2.5 出發(fā)株623與突變株623-8及623-16的形態(tài)特征觀察

由表1和圖6可知，突變株623-8和623-16在形態(tài)特征上與出發(fā)株623的差別主要體現(xiàn)在藻絲長度方面，出發(fā)株623藻絲較短，僅為246.58μm，較短的藻絲在培養(yǎng)中不易聚集成團，均勻分布在培養(yǎng)基中，突變株623-8的藻絲長度平均為762.16μm，而突變株623-16的藻絲長度平均為1324.5μm，在培養(yǎng)中極易聚集成團，且上浮性好，易于采收，是鈍頂節(jié)旋藻大規(guī)模養(yǎng)殖中重要的性狀。此外，突變株的螺距分別為74和82μm，均小于出發(fā)株的106μm，但差別不明顯。螺旋直徑?jīng)]有變化，均為32μm。

2.6 出發(fā)株與突變株的培養(yǎng)條件優(yōu)化及正交實驗結(jié)果分析

對光照強度、溫度、pH和藻株進行4因素3水平正交實驗，見表2、3。

由表3可知，對于生物量，k1A>k2A>k3A，k2B>k1B>k3B，k2C>k1C>k3C，說明組合A1、B2、C2，即pH8.5、光照強度45μmol·m-2·s-1、培養(yǎng)溫度28℃是最適宜鈍頂節(jié)旋藻生長的條件。k2D>k3D>k1D，說明不考慮培養(yǎng)條件的情況下突變株623-8的生物量高于突變株623-16，而且兩者均高于出發(fā)株623。突變株623-8和623-16的生物量分別比出發(fā)株623高67.86%和46.43%。

(A：出發(fā)株623;B：突變株623-8;C：突變株623-16。比例尺：200 μm。A:Original A. platensis 623. B: Mutant strain 623-8. C:Mutant strain 623-16 Scale bar: 200 μm.)

圖6 鈍頂節(jié)旋藻出發(fā)藻株623及其突變株623-8和623-16的形態(tài)觀察

Fig.6 Morphological observations between the originalA.platensis623 and its mutant strains

表1 出發(fā)株623與突變株623-8及623-16的形態(tài)參數(shù)比較

表2 生物量、蛋白含量、脂類含量與乙酰輔酶A羧化酶活性正交實驗表

表3 節(jié)旋藻正交實驗的k值和r值分析

注：因子A為pH，因子B為光照強度，因子C為培養(yǎng)溫度，因子D為藻株。表中k1，k2，k3分別為影響出發(fā)株與突變株的生物量，蛋白含量，脂類含量和ACCase酶活的4因子在3水平下的平均數(shù)；r為k1，k2，k3中最大與最小差值。Factor A is for pH, factor B is for light intensity, factor C is for cultivation temperature, and factor D isfor algae strains.k1,k2andk3is the average of the three levels of the four factors on biomass, protein content, lipid content, and activity of ACCase of the original strain and the mutants.ris the difference of the maximum and minimum ofk1,k2andk3respectively.

對于蛋白含量來說，k1A>k2A>k3A，k2B>k3B>k1B，k2C>k1C>k3C；說明培養(yǎng)條件在組合A1、B2、C2，即pH8.5、光照強度45mol·m-2·s-1、培養(yǎng)溫度28℃時，鈍頂節(jié)旋藻的蛋白含量最大；對于脂類含量來說，k1A>k2A>k3A，k3B>k2B>k1B，k2C>k1C>k3C，培養(yǎng)條件在組合A1、B3、C2，即pH8.5、光照強度70μmol·m-2·s-1、培養(yǎng)溫度28℃時，鈍頂節(jié)旋藻的脂類含量最大。且對于蛋白含量和脂類含量來說，均有k2D>k3D>k1D，說明不考慮培養(yǎng)條件的情況下突變株623-8的蛋白含量和脂類含量均高于突變株623-16，而且兩者均高于出發(fā)株623。突變株623-8和623-16的蛋白含量分別比出發(fā)株623高1.98%和0.84%；脂類含量高8.54%和4.88%。ACCase是生物體中多不飽和脂肪酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其活性的變化關(guān)系到脂類的積累情況。由表3可知，ACCase活性的實驗結(jié)果中，k1A>k2A>k3A，k3B>k2B>k1B，k2C>k3C>k1C，說明培養(yǎng)條件在組合A1、B3、C2，即pH8.5、光照強度70μmol·m-2·s-1、培養(yǎng)溫度28℃時ACCase的活性較高，同時在這個條件下脂類含量較高，兩者呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。k2D>k3D>k1D，突變株623-8的ACCase活性(0.58mU)高于突變株623-16(0.49mU)，分別比出發(fā)株623(0.44mU)高出31.82%和11.36%。

3 討論

亞硝基胍(NTG)作為一種超誘變劑，廣泛的應(yīng)用在微生物以及微藻的誘變育種中。殷春濤等用亞硝基胍誘變螺旋藻獲得形態(tài)特征與出發(fā)株具有顯著不同的耐低溫突變品系，其蛋白質(zhì)含量比出發(fā)品系提高9.5%[20]。Singh等用NTG誘變鈍頂螺旋藻，篩選出耐甲硝基羥乙唑和3,4-二氯苯-1,1-二甲脲能力為野生型細胞的3倍的藻株[21]。Singh等還用亞硝基胍處理極大螺旋藻，獲得氯酸鹽抗性突變株SM11和SM25[22]。喹禾靈(Quizalofop-Ethyl)是一種乙酰輔酶A羧化酶抑制劑，應(yīng)用于微藻誘變后篩選高產(chǎn)藻株的報道較少。曲曉梅等使用喹禾靈篩選微擬球藻高脂藻株，篩選出2株抗7.5μmol/L精喹禾靈藻株KA1和KA2，總脂含量達干重的46.73%和38.60%,分別比出發(fā)藻株提高了29.02%和6.57%[23]。曹小紅等將喹禾靈應(yīng)用于硅藻生產(chǎn)二十碳五烯酸(EPA)，喹禾靈濃度為0.1mmol/L時,EPA的含量從3.00%增加到3.58%，提高了19.3%，EPA占總脂肪酸的比例也由25.15%提高到了32.88%[24]。本實驗首次將NTG誘變與喹禾靈篩選結(jié)合，當(dāng)設(shè)置NTG的濃度為0.05g/L、誘變時間1h、喹禾靈篩選濃度為2.0μmol/L時，最終獲得了生長速度和蛋白含量均顯著提高的突變鈍頂節(jié)旋藻藻株623-8和623-16。表明喹禾靈是一種有效的篩選壓力，在改善種質(zhì)、新種培育和工業(yè)化養(yǎng)殖等方面有應(yīng)用價值。

通過誘變選育獲得的突變株，由于突變的隨機性，突變株生長的最適條件可能會發(fā)生變化。因此，在養(yǎng)殖之前需要對突變株培養(yǎng)的最適環(huán)境因子進行探索，優(yōu)化培養(yǎng)條件以獲得最大生長速度與蛋白積累量對于節(jié)旋藻的養(yǎng)殖有著重要的經(jīng)濟價值。本實驗探索得到的最佳培養(yǎng)條件為pH=8.5、光照強度45μmol·m-2·s-1、培養(yǎng)溫度28℃，在此培養(yǎng)條件下，突變株623-8和623-16的生物量分別比出發(fā)株高出67.86%和46.43%；蛋白含量提高1.98%和0.84%。且2株突變株在生長速度，蛋白含量及脂質(zhì)含量與乙酰輔酶A羧化酶活性呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。

脂質(zhì)含量和ACCase活性與光照強度呈正相關(guān)的關(guān)系。這與Kozaki[25]等發(fā)現(xiàn)的ACCase羧基轉(zhuǎn)移酶亞基中的二硫鍵會被光誘導(dǎo)發(fā)生氧化還原反應(yīng)而打開，激活乙酰輔酶A羧化酶活性的研究結(jié)果相符。

篩選出的2株突變株表現(xiàn)出了高于出發(fā)株的乙酰輔酶A羧化酶活性，本文僅對其活性的宏觀影響因素如溫度、光照強度和pH進行研究，在分子水平上的影響因素如編碼乙酰輔酶A羧化酶α和β亞基的基因結(jié)構(gòu)與表達水平等,還有待進一步探索。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Selection of Strains of Arthrospira platensis with High-Yield Trait by Mutation

LIU Qi, ZANG Xiao-Nan, ZHANG Xue-Cheng

(The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Stably inherited strains ofArthrospiraplatensiswith high-yield trait were obtained by using nitrosoguanidine (NTG) mutagenesis and Quizalofop-Ethyl screening. Compared with the original strain 623 ofA.platensis, the two mutants of 623-8 and 623-16 had longer filaments and easily aggregated into clusters. Moreover, higher growth rate and higher contents of protein and lipid as well as higher activities of acetyl coenzyme A carboxylase were detected. The growth rate of mutants of 623-8 and 623-16 reached their maximum of 67.86% and 46.43% respectively at 28 ℃ with pH=8.5 and light intensity of 45 μmol·m-2·s-1. Protein contents of both mutants increased by 1.98% and 0.84% respectively. While, lipid contents increased by 8.54% and 4.88%. The activities of acetyl coenzyme A carboxylase increased by 31.82% and 11.36% respectively. Our findings showed that a combination of NTG with Quizalofop-Ethyl can be used to mutate and screen theArthrospirastrains for high growth rate and high protein content, which is important to improve the yield and quality ofArthrospirain industry.

Arthrospiraplatensis; Nitrosoguanidine; mutagenesis; Quizalofop-Ethyl

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項目(BS2012HZ017)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2008AA09Z410)資助

2014-03-04；

2014-05-28

劉 奇(1987-)，男，碩士生。E-mail: liuqichris67@hotmail.com

** 通訊作者： E-mail：xczhang8@163.com

Q319+.2

A

1672-5174(2015)04-059-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140043