腸道病毒71型感染致手足口病的抗病毒藥物及疫苗研究進展

王宏杰，鄒映雪，張文雙

手足口病;腸道病毒71型;抗病毒藥物;疫苗

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是一種由多種腸道病毒引起的急性傳染病，多發(fā)生于兒童，尤其是＜3歲的嬰幼兒[1]，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。少數(shù)患兒可并發(fā)無菌性腦膜炎、腦干腦炎、腦脊髓炎等嚴重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，預(yù)后差，病死率高[2]。此類患兒多數(shù)由腸道病毒71型(EV71)感染引起[3]。目前，針對EV71臨床上尚無有效的抗病毒藥物或已被批準的疫苗應(yīng)用。因此，研制有效的抗EV71的藥物及疫苗是未來醫(yī)學(xué)研究的重點。現(xiàn)將近年來國內(nèi)外有關(guān)EV71抗病毒藥物、疫苗的研究進展綜述如下。

1 病原學(xué)

EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬成員，病毒的形態(tài)為無包膜正二十面體結(jié)構(gòu)，大小約為33～35 nm[4]，基因組為一長約7．4 kb的單正鏈RNA分子，基因組兩端為保守的3＇和5＇非編碼區(qū)，中間為連續(xù)的開放讀碼框架，編碼含2 194個氨基酸的多聚蛋白，可進一步水解為P1/P2/P3 3個前體蛋白，病毒的單鏈RNA具有感染性。根據(jù)基因序列的不同，進一步劃分為A、B、C3個基因型，其中B型和C型又可進一步分為B1、B2、B3、B4、B5以及Cl、C2、C3、C4和C5亞型[5-6]。研究結(jié)果顯示，一方面EV71毒性決定簇在基因族中并非單一位點，病毒的毒性是多個位點共同作用的結(jié)果;另一方面，復(fù)雜的宿主因素，對病毒的毒性也有影響[7]。

2 EV71 的抗病毒藥物

目前臨床上對EV71病毒感染主要是對癥及支持治療，因此研制有效的抗病毒藥物成為目前的重要課題。

2. 1蛋白酶體系統(tǒng)抑制劑 有研究發(fā)現(xiàn)吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)發(fā)揮了潛在的抗EV71病毒的作用。經(jīng)過PDTC處理的EV71感染Vero細胞，發(fā)現(xiàn)病毒RNA合成、病毒蛋白表達以及病毒子代的產(chǎn)生均受到明顯抑制。相似于之前報道的PDTC對泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)PDTC降低了EV71感染細胞的多泛素化蛋白水平。細胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21和p53的增加積累進一步證實了PDTC 對UPS的抑制作用，它們通常通過UPS降解，然而本研究它們的水平?jīng)]有變化。還發(fā)現(xiàn)PDTC對蛋白酶體的活性沒有影響。因此，PDTC對UPS的下調(diào)作用是它對泛素化抑制作用的結(jié)果。更為重要的是，PDTC的抗病毒作用導(dǎo)致了對UPS的抑制作用; MG132作為一個強有力的蛋白酶體抑制劑，對EV71感染細胞的細胞病變效應(yīng)和病毒蛋白合成產(chǎn)生明顯的抑制作用。PDTC的抗氧化性能不能發(fā)揮其抗病毒作用，是因為N－乙酰－L－半胱氨酸作為一個強有力的抗氧化劑并不能抑制病毒的復(fù)制。病毒感染前2小時給予PDTC，然后在沒有PDTC的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，這種方法并不能抑制病毒的蛋白合成，但是PDTC的抗氧化作用沒有改變。在病毒感染早期應(yīng)用PDTC會顯著地抑制由EV71感染引起的細胞凋亡?？傊?，PDTC作為一種潛在的抗病毒化合物具有抗病毒和抗凋亡雙重作用[8]。EV71 3C蛋白酶在病毒的復(fù)制中完成多項任務(wù)，通過合成來自EV71病毒多聚蛋白裂解位點的一個小的熒光標記肽，檢測EV71 3C蛋白酶的裂解效率。先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化的快速、高效的檢測為針對3C蛋白酶的抗病毒藥物的發(fā)展提供了理想的平臺[9]。

2. 2 RNA聚合酶抑制劑 有研究發(fā)現(xiàn)6-溴-2-[1-(2，5-二甲基苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-yl]喹啉-4-羧酸(BPR-3P0128)顯示了很好的抗EV71病毒作用，BPR-3P0128在病毒感染的早期抑制病毒的復(fù)制，目標是EV71RNA依賴的RNA聚合酶以及VPg尿苷酰化，同時減少病毒RNA的累積水平以及抑制EV71的病毒復(fù)制[10]。有研究評估了27種核苷類似物，發(fā)現(xiàn)了一種腺苷核苷類似物(NITD008，此前報道其是專門抑制黃病毒的一種抗病毒試劑)，能夠在Vero細胞中有效抑制不同EV71菌株的傳播。磷酸化NITD008作為鏈終止的功能直接抑制EV71RNA依賴的RNA聚合酶的活動，但是不影響EV71VPg尿苷?；^程。NITD008和rupintrivir (AG7088)(一種蛋白酶抑制劑)的協(xié)同抗EV71被記錄在案，NITD008和其它抑制劑的潛在聯(lián)合治療來治療EV71感染[11]。

2. 3 mRNA抑制劑 微小RNAs是一類小的非編碼RNAs，長約20個核苷酸，在病毒生物學(xué)過程(包括抗病毒防御)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的角色。然而，微小RNAs在EV71復(fù)制及發(fā)病機制中的作用還未揭示。有研究發(fā)現(xiàn)miR-27a的表達顯著地減少受EV71感染的細胞。有趣的是，在qPCR以及Western blotting中通過病毒滴定，miR-27a的過度表達能夠抑制EV71的復(fù)制。通過計算分析和熒光素酶報告基因檢測，研究者發(fā)現(xiàn)EGFR mRNA是miR-27a的一個真正的目標。此外，在qPCR以及Western blotting中，miR-27a能夠降低EGFR的表達。而且，miR-27a對EGFR的抑制作用降低了Akt和ERK的磷酸化(方便EV71的復(fù)制)。結(jié)果顯示R-27a通過抑制EGFR而發(fā)揮了抗EV71病毒感染作用[12]。

2. 4 B細胞免疫調(diào)節(jié)劑 研究發(fā)現(xiàn)EV71感染的小鼠體內(nèi)的B細胞數(shù)量是減少的。去鐵胺是一種海洋微生物天然產(chǎn)物，它可以補償EV71感染鼠體內(nèi)降低的B細胞水平。去鐵胺治療后中和抗體滴度也是升高的。此外，去鐵胺減輕了EV71 感染引起的癥狀、死亡率以及肌肉的損傷。研究顯示，去鐵胺作為一種B細胞免疫調(diào)節(jié)劑，其有進一步抵抗EV71感染的潛能[13]。

2. 5蘆竹堿衍生物 研究發(fā)現(xiàn)，基于細胞的測定中，蘆竹堿和21蘆竹堿衍生物有抗EV71病毒的作用。18衍生物顯示了一定程度的抑制EV71作用，在此，它們有效的抑制病毒誘導(dǎo)的細胞病變效應(yīng)，但是，蘆竹堿鉛化合物卻沒有抗EV71的作用。這種化合物作用在EV71感染的初始階段，而不是直接的滅活病毒、抑制病毒的吸收或者影響病毒從細胞的釋放。所有這些衍生物中，含有吡啶和苯并噻唑單元的復(fù)合物4S是最有抗EV71的潛力的。更進一步的研究表明，4s衍生物能夠明顯的抑制病毒RNA的復(fù)制，蛋白質(zhì)合成以及病毒誘導(dǎo)的RD細胞凋亡。這些研究表明，4s衍生物或許是治療EV71感染的一種可行的制劑，并且這些蘆竹堿衍生物為進一步設(shè)計與合成潛在的抗病毒藥物提供了有前景的途徑[14]。

2. 6病毒異構(gòu)體 以前的結(jié)構(gòu)研究表明，EV71感染的細胞產(chǎn)生兩種抗原性不同的結(jié)構(gòu)形式，擴展的空衣殼(有時也被稱為原殼體)和傳染性病毒。EV71病毒的抗原表位揭示原殼體和病毒之間的結(jié)構(gòu)是不同的。體外的結(jié)構(gòu)功能研究表明，原殼體能夠隔離抗體而增強EV71的感染。該研究的結(jié)果提示，EV71原殼體和病毒的構(gòu)象不同為今后的抗病毒治療提供了方法[15]。

3 EV71 疫苗

阻止EV71爆發(fā)的最有效手段是進行研發(fā)EV71疫苗。鑒于近年來手足口病在我國的爆發(fā)流行，故研制經(jīng)濟有效的疫苗顯得尤為重要。

3. 1 EV71滅活疫苗 目前，亞洲有幾個國家已經(jīng)研發(fā)了EV71滅活疫苗。中國大陸有三家公司已經(jīng)完成了滅活EV71全病毒疫苗的三期臨床試驗，而臺灣和新加坡的兩家公司也已經(jīng)完成了一期臨床試驗。這些臨床試驗的結(jié)果表明，EV71疫苗具有高度安全性和免疫原性。EV71引起的手足口病保護率超過90%，EV71相關(guān)疾病的保護率超過80%[16]。以靈長類動物為模型的試驗亦支持了上述觀點。該研究評估了福爾馬林滅活的EV71疫苗長期的免疫原性和安全性。在獼猴0、3、6周時用5～10 μg劑量的EV71疫苗接種，以AlPO4佐劑或者PBS作為對照。在長達56周的研究中，免疫接種的獼猴局部既無發(fā)熱亦無紅腫。一次免疫接種之后，EV71疫苗接種組血清中和抗體效價有4倍的升高，同時發(fā)現(xiàn)劑量依賴的IgG抗體反應(yīng)。3次疫苗接種后EV71疫苗接種獼猴的中和抗體效價達到高峰，然后逐漸下降;然而，免疫接種獼猴的中和抗體滴度一直保持100%，直至試驗結(jié)束[17]。

3. 2 EV71多聚蛋白疫苗 有研究通過畢赤酵母發(fā)現(xiàn)了一種經(jīng)濟有效的產(chǎn)生EV71多聚蛋白(P1蛋白)的方法，并且評價了P1蛋白作為抵抗EV71病毒一種候選疫苗的潛力。研究數(shù)據(jù)表明，P1蛋白產(chǎn)生了針對不同EV71亞型的持續(xù)高水平的交叉中和抗體，并且引起了明顯的脾細胞增殖。高水平的IL-10和IFN-γ表明，P1蛋白誘導(dǎo)了Th1和Th2細胞的免疫反應(yīng)。更有趣的是，接受P1蛋白免疫接種的雌鼠與其新生子代之間產(chǎn)生了抵抗不同EV71亞型的交叉保護反應(yīng)。相對于熱滅活的EV71來說，P1蛋白增強了體液和細胞免疫反應(yīng)，并且顯示了針對不同EV71亞型的良好的交叉保護作用。畢赤酵母產(chǎn)生的EV71P1蛋白是一種有前景的候選疫苗[18]。

3. 3構(gòu)象疫苗 有研究對兩種不同的空粒子的晶體結(jié)構(gòu)進行分析:在沒有明顯的衣殼結(jié)構(gòu)改變的情況下，外源性肽的插入能夠很好的暴露于顆粒表面。重要的是，此種插入似乎不影響病毒的脫殼過程，而是說明，另一種重組病毒和EV71之間的脫殼過程的構(gòu)象相似。此研究提供了抵抗手足口病的疫苗發(fā)展的見解[19]。

3. 4雙價疫苗 福爾馬林滅活的EV71疫苗能夠阻止EV71的感染，而不能阻止COXA16的感染，下一步的目標是研究福爾馬林滅活的EV71、COXA16雙價疫苗，進而研制包括能夠阻止其它柯薩奇病毒以及?？刹《镜亩鄡r手足口病疫苗[20]。有研究比較了四種單價疫苗和兩種雙價疫苗，包括福爾馬林滅活的EV71病毒、EV71病毒樣顆粒、福爾馬林滅活的CVA16病毒、CVA16病毒樣顆粒，以及福爾馬林滅活的等效EV71 + CVA16病毒、EV71 + CVA16病毒樣顆粒。IgG和中和抗體滴度表明，EV71和CVA16之間的免疫原性沒有免疫干擾。在IgG的子類分型中，IgG1與IgG2b在所有的疫苗組分中占主要地位。此外，小鼠的血清中產(chǎn)生了抵抗EV71和CVA16亞型的交叉中和抗體。體內(nèi)具有挑戰(zhàn)性的試驗研究表明，接受疫苗接種的動物免疫血清可以賦予新生鼠被動的免疫保護，而免于EV71的14 LD50以及CVA16的50 LD50的致命性挑戰(zhàn)。研究結(jié)果表明雙價疫苗在手足口病的疫苗發(fā)展中是很有前景的。病毒樣顆粒具有比病毒滅活疫苗更為安全的優(yōu)勢，病毒樣顆粒應(yīng)該包括EV71和CVA16抗原，以此來阻斷手足口病病毒的傳播[21]。有研究基于乳化佐劑組合的效力遞送系統(tǒng)設(shè)計與優(yōu)化EV71候選疫苗，接著，對含有EV71/ CVA16聯(lián)合抗原的鼠進行免疫原性研究。亞微米顆粒乳化的單一劑量的滅活EV71病毒顆粒誘發(fā)了潛在的抗原特異性的中和抗體反應(yīng)，同時持續(xù)產(chǎn)生中和EV71的抗體反應(yīng)。雙價EV71/CVA16病毒顆粒的單一劑量的免疫原性研究表明，CVA16抗原不能引起CVA16中和抗體的產(chǎn)生反應(yīng)，但是，不能影響EV71特異中和抗體反應(yīng)。升壓劑量的乳化雙價EV71/CVA16候選疫苗對于獲得高滴度CVA16特異中和抗體的產(chǎn)生反應(yīng)的血清轉(zhuǎn)換是必需的。本次研究的結(jié)果對于設(shè)計與發(fā)展手足口病及其它新興傳染病預(yù)防性疫苗是很重要的[22]。

直到現(xiàn)在尚無有效的商業(yè)化EV71疫苗上市，一旦EV71疫苗獲得官方批準，就應(yīng)該形成優(yōu)化安全的以證據(jù)為基礎(chǔ)的策略。EV71疫苗的免疫策略應(yīng)該包括幾個因素:目標人群的年齡，初次免疫劑量，加強劑量的需要，能否與其它疫苗同時使用，經(jīng)濟價值，計劃能力，以及公眾的認可程度。一旦EV71疫苗投放市場，必須通過大量的人群來監(jiān)測疫苗的有效性和安全性，必須評估手足口病的流行病學(xué)，確保疫苗接種時機與流行病學(xué)相符。中國的評估尤其重要，因為全球沒有其它的EV71疫苗[23]。

綜上所述，手足口病近幾年已經(jīng)成為威脅公共健康的一種嚴重的腸道病毒傳染病。由EV71引起者易引起嚴重的中 樞神經(jīng)系統(tǒng)合并癥，死亡率高。隨著對于手足口病認識的提高，積極的救治明顯減少了死亡率。積極加大抗EV71治療的投入以研制有效的抗病毒藥物，顯得較為迫切，同時積極研究EV71病毒感染的發(fā)病機制，為提供臨床切實可行的疫苗亦是今后的研究重點。

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A

1008-7044(2015)04-0412-03

10．14126/j．cnki．1008－7044．2015．04．058

天津市兒童醫(yī)院感染科，300074

王宏杰(1977－)，男，天津市人，主治醫(yī)師，研究生。

2015-03-10)