郝艷紅，李 敏，楊 軍

血清濃度對(duì)小鼠骨髓干細(xì)胞生物特征的影響

郝艷紅1，李 敏1，楊 軍2

目的 研究不同血清濃度處理對(duì)小鼠骨髓干細(xì)胞生物特性的影響。方法 小鼠全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞，原代細(xì)胞用10%、15%、20%血清體積分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖情況。結(jié)果 細(xì)胞在血清濃度為10%的培養(yǎng)基中增殖速度快，細(xì)胞形態(tài)以梭型為主；血清濃度為20%時(shí)細(xì)胞胞體面積增大，且增殖速度減慢。結(jié)論 體外培養(yǎng)小鼠骨髓干細(xì)胞的最佳血清體積分?jǐn)?shù)為10%。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞；體外培養(yǎng)；生長(zhǎng)特征

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類(lèi)來(lái)源于中胚層的成體干細(xì)胞，在特定誘導(dǎo)條件下，具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等不同細(xì)胞分化的能力。小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在骨髓中僅占0.001%～0.01%，與人、大鼠和兔MSCs相比，MSCs的培養(yǎng)相對(duì)比較難。有文獻(xiàn)報(bào)道，不同的換液時(shí)間、血清濃度、氧濃度及培養(yǎng)基類(lèi)型、細(xì)胞接種濃度等對(duì)小鼠MSCs體外培養(yǎng)都產(chǎn)生影響[1]。本實(shí)驗(yàn)探討最佳小鼠MSCs體外培養(yǎng)的最佳血清濃度，從而為小鼠骨髓干細(xì)胞體外培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS， Gibc)，垂直潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F)， Olmyplus倒置相差顯微鏡(CKX41)，低速臺(tái)式大容量離心機(jī)(TDL-50B)，恒溫培養(yǎng)箱(HH·CP-7)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4周齡昆明小鼠16只，體質(zhì)量18～25 g。

1.2 方法

1.2.1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的取材及細(xì)胞懸液制備 4周齡昆明小鼠，頸椎脫臼處死，于75%乙醇中浸泡5 min，超凈工作臺(tái)內(nèi)分離股骨、脛骨，剪去干骺端，PBS沖洗骨髓腔至發(fā)白。細(xì)胞懸液1 500 r/min離心20 min，棄上清，再用PBS清洗1次。加入無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105/mL。

1.2.2 培養(yǎng)條件 將MSCs懸液接種于20 mL玻璃培養(yǎng)瓶中，加入血清，調(diào)整血清濃度至10%、15%、20%，37℃、5%CO2、95%濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。3 d后首次全量更換培養(yǎng)液，每3 d更換培養(yǎng)基。

1.2.3 MSCs增殖及生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察 倒置顯微鏡下觀察不同濃度血清條件下細(xì)胞的貼壁情況、細(xì)胞形態(tài)及達(dá)80%融合所需要的時(shí)間。

1.2.4 細(xì)菌污染鑒定 連續(xù)培養(yǎng)30 d，取細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基2 mL進(jìn)行革蘭氏染色，菌鑒。

2 結(jié)果

2.1 MSCs形態(tài)及貼壁情況 MSCs接種24 h后，細(xì)胞開(kāi)始貼壁，呈圓形。48 h后呈梭形生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，偶見(jiàn)胞體有多個(gè)突起的細(xì)胞。72 h換液后，細(xì)胞分散或聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)的變化以長(zhǎng)梭形為主。96 h后分散生長(zhǎng)細(xì)胞減少或消失，細(xì)胞多呈漩渦狀或放射狀層疊交織生長(zhǎng)，無(wú)接觸抑制。接種7 d后，梭形細(xì)胞逐漸被多角形細(xì)胞代替，個(gè)別細(xì)胞呈長(zhǎng)條索狀，且可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)胞體中出現(xiàn)黑色顆粒，立體感減弱，懷疑細(xì)胞老化。MSCs整體生長(zhǎng)趨勢(shì)是基質(zhì)細(xì)胞的鋪壁面積越來(lái)越大。

2.2 不同濃度血清對(duì)MSCs增殖的影響 10%、15%兩組MSCs生長(zhǎng)狀況較20%組好，首次換液后細(xì)胞總數(shù)及梭形細(xì)胞數(shù)均高于20%組。9 d后10%、15%組細(xì)胞增殖至80%，達(dá)到傳代要求，高倍鏡下觀察細(xì)胞立體感強(qiáng)，20%組細(xì)胞增殖不足50%，且高倍鏡下胞質(zhì)中見(jiàn)黑色顆粒。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，未傳代的10%、15%兩組于13 d后細(xì)胞體擴(kuò)展，生出毛刺裝突起，呈老化狀態(tài)，失去增殖能力。

2.3 MSCs污染鑒定 連續(xù)培養(yǎng)30 d后，可見(jiàn)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)部底面出現(xiàn)黑色顆粒，經(jīng)鑒定，未見(jiàn)污染，可能是細(xì)胞老化所致。

3 討論

人骨髓基質(zhì)細(xì)胞在基因治療、細(xì)胞治療、組織工程等方面應(yīng)用前景廣闊，通過(guò)干細(xì)胞移植，可以治療腦缺血、脊髓損傷、骨損傷等。但骨髓中BMSCs 含量稀少，要進(jìn)行體外的相關(guān)研究，需進(jìn)行體外純化和擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)采用不同的血清濃度培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)最佳的血清濃度是10%～15%組，20%組細(xì)胞增殖較慢且細(xì)胞發(fā)生分化，這與文獻(xiàn)報(bào)道的較高的血清體積分?jǐn)?shù)可能提高培養(yǎng)液的滲透壓使細(xì)胞難以適應(yīng)一致[2]。細(xì)胞密集區(qū)域表現(xiàn)為放射狀，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，相互重疊成多層，這為鈣化組織提供了必不可少的三維結(jié)構(gòu)[3]。

本研究還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞胞體增大老化或呈長(zhǎng)條型，不利于增殖，這可能與細(xì)胞的單層培養(yǎng)有關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道單層培養(yǎng)細(xì)胞增殖速度較快，短期內(nèi)細(xì)胞表型不會(huì)變化，但隨著傳代次數(shù)的增多，細(xì)胞會(huì)逐漸失去特有的表型，發(fā)生分化現(xiàn)象。如關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)后漸呈梭形，合成和分泌Ⅱ型膠原、蛋白多糖的能力減少，具有成纖維細(xì)胞的特征[4]。因此，應(yīng)選用生長(zhǎng)狀態(tài)較好的1～2代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)[5]?？股爻Ｓ脕?lái)預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染，如青鏈霉素、慶大霉素等。有研究報(bào)道青鏈霉素在100～500 U/mL范圍內(nèi)能促進(jìn)人臍帶血干細(xì)胞的增殖，降低凋亡，但大量使用會(huì)降低臍帶血干細(xì)胞的歸巢和黏附能力[6]。本實(shí)驗(yàn)在未使用青鏈霉素的條件下，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作，連續(xù)培養(yǎng)同一細(xì)胞30 d，經(jīng)鑒定未見(jiàn)細(xì)菌污染。

[1] 施鎮(zhèn)江,黃桂琴,王廷華,等.血清量及首次換液時(shí)間對(duì)熒光小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外增值的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2005, 36(4):566-570.

[2] 王改琴,杜小麗,吳宏.細(xì)胞密度和血清對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,32(11):1178-1181.

[3] 徐忠世,楊述華,肖德明,等.兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2007:27(4) :550-552.

[4] 胡春江,徐宏光.細(xì)胞培養(yǎng)方式與力學(xué)刺激[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2010,33(6):19-20.

[5] 張坡,黃嵐,蔣世忠,等.小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞參與缺血組織血管再生及時(shí)相關(guān)系[J].中國(guó)臨床康復(fù),2005,9(3):143-145.

[6] 李昆,于秋艷,金玉楠,等.細(xì)胞培養(yǎng)中枯草桿菌污染的防控[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2007, 34(11):2140-2141.

Growth Characteristics of Murine Bone Marrow Stromal Cells underDifferent Cell Culture Densities in Vitro

HAO Yan-hong,LI Min,YANG Jun

(Xinyang Vocational and Teachnical College,Xinyang 464000,China)

ObjectiveTo study the effect of different cell culture densities on growth of mice bone marrow stromal cell in vitro.MethodsBone marrow stromal cells were cultured in DMEM containing 10%,15% and 20% FBS respectively. The amplification of MSCs was determined.ResultsThe cultured cells were proliferated well in DMEM containing 10% FBS. Spindle cells were observed when the adhered cells nearly to fuse to monolayer. The cytoplasm was magnifying, and the cells proliferation was lower.ConclusionThe appropriate concentration of FBS is 10% for bone marrow stromal cell in vitro culture.

bone marrow stromal cells；in vitro culture；growth

河南省科技發(fā)展計(jì)劃(科技廳)(082102310044)

2015-01-19

1.信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南信陽(yáng) 464000 2.信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院，河南信陽(yáng) 464000

郝艷紅(1982-)，女，河南鄭州人，講師，從事預(yù)防醫(yī)學(xué)教學(xué)工作。

楊軍，男，副主任醫(yī)師，E-mail：Sunday0914@126.com

R34

A

1672-688X(2015)01-0019-02