楊文華，孫路全，劉東妮，馬金雙，張向宇(天津市北辰醫(yī)院，天津300400;天津醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院)

橙皮苷聯(lián)合氟化鈉對體外牛牙釉質(zhì)礦化的影響

楊文華1，孫路全1，劉東妮1，馬金雙1，張向宇2
(1天津市北辰醫(yī)院，天津300400;2天津醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院)

摘要:目的對牛牙進行體外抑制脫礦和再礦化實驗，探討橙皮苷聯(lián)合氟化鈉對牙釉質(zhì)礦化的影響。方法用48顆新鮮牛牙制備牙釉質(zhì)切片，隨機分為四組，分別采用氟化鈉(陽性對照組)、去離子水(陰性對照組)、橙皮苷(實驗1組)、橙皮苷聯(lián)合氟化鈉(實驗2組)進行體外抑制脫礦和再礦化實驗。測定各組藥物處理釉質(zhì)切片后鈣離子和磷離子的流出量、再礦化實驗中釉質(zhì)表面顯微硬度，利用X線能譜儀分析釉質(zhì)標(biāo)本表面鈣、磷原子含量并計算鈣原子/磷原子。結(jié)果實驗1組鈣離子和磷離子的流出量、釉質(zhì)表面顯微硬度與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;實驗2組鈣離子和磷離子的流出量、釉質(zhì)表面顯微硬度與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)。結(jié)論在體外條件下，氟化鈉可抑制牛牙釉質(zhì)脫礦促進再礦化，橙皮苷對牛牙釉質(zhì)無明顯直接抑制脫礦和促進再礦化作用，與氟化鈉聯(lián)用無明顯協(xié)同作用，但橙皮苷可能具有穩(wěn)定牙釉質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的作用，有助于牙釉質(zhì)再礦化。

關(guān)鍵詞:橙皮苷;氟化鈉;再礦化;抑制脫礦;牛牙

橙皮苷是從檸檬中提取的一種黃酮類物質(zhì)，具有較強的抗炎活性［1］，能抑制細菌、真菌、病毒生長和繁殖［2］。研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷具有抗牙齦卟啉單胞菌的作用［3］，對變異鏈球菌乳酸脫氫酶及蔗糖酶有很好的抑制作用，可減少細菌產(chǎn)酸，預(yù)防齲齒［4，5］。氟化鈉具有抑制釉質(zhì)脫礦和促進再礦化的作用［6］。2014年，我們對牛牙進行體外抑制脫礦和再礦化實驗，檢測橙皮苷對牙釉質(zhì)礦化的影響及其與氟化鈉聯(lián)合應(yīng)用的效果，為天然抗齲藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料選擇同一種類2～3歲牛的新鮮下頜，體視顯微鏡下觀察，取無齲損、氟斑、裂痕牙48顆，去污，分離冠根，用高速切割機沿正中矢狀長軸將每個切牙冠切成6 mm×6 mm×2 mm的釉質(zhì)切片，丙烯酸樹脂包埋后暴露唇面釉質(zhì)，留出5 mm×5 mm釉質(zhì)面，拋光，超聲清洗，自然干燥。

1.2牙釉質(zhì)鈣、磷離子濃度檢測

1.2.1抑制脫礦實驗取24顆牛牙的釉質(zhì)切片，隨機分為陰性對照組(加入去離子水)、陽性對照組(加入氟化鈉1 mg/mL)［10］、實驗1組(加入橙皮苷5 mg/mL)、實驗2組(加入橙皮苷5 mg/mL+氟化鈉1 mg/mL)［11］各6片，分別加入相應(yīng)藥物30 mL后，以100 r/min勻速攪拌15 min，棄處理液，用去離子水沖洗，加入脫礦液(50 mmol/L乙酸、1.5 mmol/L氯化鈣、0.9 mmol/L磷酸二氫鉀，用氫氧化鉀將pH調(diào)至5.0) 30 mL，37℃水浴100 r/min勻速攪拌30 min，取酸蝕后的脫礦液，用全自動生化分析儀測定鈣、磷離子濃度。

1.2.2再礦化實驗取24顆牛牙的釉質(zhì)切片，浸入30 mL脫礦液中，37℃處理96 h。將脫礦后的切片按照1.2中的分組方法隨機分為四組，再次浸入脫礦液中反應(yīng)14 h，分別加入對應(yīng)藥物反應(yīng)2 h，再礦化液［1.5 mmol/L氯化鈣、0.9 mmol/L磷酸二氫鉀、130 mmol/L氯化鉀、20 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，用氫氧化鉀調(diào)pH至7.0］反應(yīng)8 h。每兩個步驟之間使用緩沖液(130 mmol/L氯化鉀、20 mmol/L HEPES，用氫氧化鉀調(diào)pH至7.0)沖洗5 min，連續(xù)循環(huán)8 d。收集循環(huán)中的脫礦液，用全自動生化分析儀測定鈣、磷離子濃度。

1.3觀察指標(biāo)的測算①鈣、磷離子流出量(ESR) : ESR=(未使用實驗藥物處理釉質(zhì)切片前各組脫礦液中離子濃度－實驗藥物處理釉質(zhì)切片后各組脫礦液中離子濃度)/未使用實驗藥物處理釉質(zhì)切片前各組脫礦液中離子濃度。②釉質(zhì)表面顯微硬度(SMH)及SMH恢復(fù)率(EMHR) :脫礦處理前、脫礦后及再礦化實驗后，將標(biāo)本置于顯微硬度計(努氏壓頭，9.8 N，20 s)下，在每個標(biāo)本釉質(zhì)表面中央垂直測5個點，讀取SMH值，根據(jù)SMH計算EMHR，EMHR=(再礦化實驗后的SMH－脫礦后的SMH)/(脫礦前的SMH－脫礦后的SMH)。③鈣磷原子比值:使用X射線能譜儀，采用質(zhì)譜分析法檢測再礦化實驗后各組牙釉質(zhì)表面鈣、磷原子含量，并計算鈣原子/磷原子。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用珋x±s表示，對符合正態(tài)分布的計量資料和不符合正態(tài)分布的計量資料通過Box-cox轉(zhuǎn)換后進行單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較。α=0.05。

2　結(jié)果

2.1抑制脫礦后及再礦化后各組鈣、磷ESR抑制脫礦后及再礦化后，實驗1組鈣、磷ESR顯著高于陽性對照組(P＜0.05)，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;實驗2組鈣、磷ESR顯著低于陰性對照組(P＜0.05)，與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1　抑制脫礦實驗及再礦化實驗后各組鈣、磷ESR比較(n=6，mmol/L，±s)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.05;與陽性對照組比較，#P＜0.05。

組別　鈣ESR抑制脫礦后　再礦化后磷ESR抑制脫礦后　再礦化后陰性對照組4.54±0.40　0.90±0.15　2.39±0.27　1.32±0.05陽性對照組　2.32±0.21*0.48±0.04*　1.31±0.09*0.54±0.03*實驗1組　4.67±0.33#0.81±0.08#　2.38±0.18#1.23±0.17#實驗2組　2.18±0.22*0.47±0.07*　1.24±0.09*0.47±0.05*

2.2再礦化后各組釉質(zhì)SMH及EMHR實驗1 組EMHR顯著低于陽性對照組(P＜0.05)，實驗2組EMHR顯著高于陰性對照組(P＜0.05)。見表2。

表2　再礦化后各組釉質(zhì)SMH及EMHR比較(n=6，±s)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.05;與陽性對照組比較，#P＜0.05。

組別SMH(kg/mm2)脫礦前　脫礦后　再礦化后EMHR(%)陰性對照組　410.96±7.18　317.26±6.16　320.73±7.33#3.91±10.66陽性對照組　413.80±8.06　321.10±5.89　369.07±9.48*51.48±10.76*實驗1組　409.71±7.91　320.63±6.32　335.45±9.03#15.90±12.11實驗2組　409.94±7.82　319.00±5.76　377.01±8.88*63.82±11.74*

2.3再礦化后各組釉質(zhì)表面鈣、磷原子及鈣原子/磷原子實驗1、2組與陰性對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P均＜0.05)，與陽性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。見表3。

表3　再礦化實驗各組釉質(zhì)表面鈣、磷原子含量及鈣原子/磷原子(n=6，±s)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.05;與陽性對照組比較，#P＜0.05。

組別　鈣原子(%)　磷原子(%)　鈣原子/磷原子陰性對照組　16.50±3.98#12.51±1.74#　1.30±0.14#陽性對照組　23.24±2.45*14.04±0.91*　1.65±0.09*實驗1組　18.48±1.76*12.48±1.54*　1.49±0.17*實驗2組　18.09±1.23*11.57±0.63*　1.57±0.19*

3　討論

齲病是在致齲菌感染的基礎(chǔ)上，發(fā)生牙體硬組織的無機成分脫礦、有機成分溶解等一系列組織學(xué)改變的慢性感染性疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，患齲牙齒在唾液中維持著脫礦—再礦化的生物循環(huán)過程，對齲病治療應(yīng)著重于抑制牙體表面脫礦和降低致齲菌酶活性方面。再礦化是在已經(jīng)脫礦的牙齒硬組織內(nèi)發(fā)生礦物質(zhì)的重新沉積并進行結(jié)晶化。研究證實，早期齲損中，氟可以吸附或結(jié)合于脫礦釉質(zhì)表面，促進鈣、磷的吸收沉積，促使晶體生長［8］。近年來，天然產(chǎn)物因其來源豐富、取材方便、療效顯著、不良反應(yīng)小等優(yōu)點成為防齲研究的熱點。橙皮苷是檸檬提取物的主要成分之一，是一種藥理活性確切、應(yīng)用廣泛的黃酮類化合物，具有抑菌、抗炎、抗氧化［9］等藥理活性。研究證實，檸檬提取物能抑制常見口腔致齲菌的生長［10］，抑制變形鏈球菌在硬組織表面生長黏附［11，12］，對變形鏈球菌和絨毛鏈球菌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶有抑制作用［13，14］。

本研究顯示，抑制脫礦實驗中，橙皮苷無明顯抑制釉質(zhì)溶解度的作用，其與氟化鈉聯(lián)合應(yīng)用與單獨使用氟化鈉對釉質(zhì)溶解度的抑制作用無明顯差異，提示橙皮苷沒有抑制釉質(zhì)溶解的作用;再礦化實驗中，實驗1組與陰性對照組對釉質(zhì)表面顯微硬度的作用無明顯差異，與陽性對照組、實驗2組有顯著差異，說明橙皮苷無明顯促進脫礦釉質(zhì)再礦化的作用，與氟化鈉聯(lián)合應(yīng)用不增強且不影響氟化鈉促進釉質(zhì)再礦化的作用。Islam等［3］報道，橙皮苷可以抑制膠原酶活性，保存牛牙牙本質(zhì)膠原，可能促進再礦化過程。本研究結(jié)果與其不同，可能與我們采用的牛切牙釉質(zhì)中無機物和有機物成分含量以及橙皮苷濃度不同有關(guān)。X線能譜分析各組藥物處理后牙釉質(zhì)表面鈣原子/磷原子結(jié)果顯示，實驗1組、實驗2組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)無意義，實驗1組鈣原子/磷原子增高，提示橙皮苷可能具有穩(wěn)定牙釉質(zhì)表面晶體結(jié)構(gòu)作用，有助有牙釉質(zhì)再礦化，其具體作用機制需進一步研究。

本研究采用質(zhì)譜分析法分析再礦化實驗后的各組樣本表面成分及含量。質(zhì)譜分析操作簡便、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快，可以快速準(zhǔn)確地反映各組標(biāo)本中磷離子含量。實驗結(jié)果表明，橙皮苷與氟化鈉聯(lián)合使用沒有明顯增強氟化鈉促進牛牙釉質(zhì)再礦化的作用，對抑制釉質(zhì)脫礦和再礦化也無明顯抑制作用，但橙皮苷可能具有穩(wěn)定牙釉質(zhì)表面晶體結(jié)構(gòu)的作用。下一步我們將對橙皮苷治療齲病的濃度進行觀察。

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·臨床研究·

(收稿日期:2014-10-25)

文章編號:1002-266X(2015) 18-0038-03

文獻標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R780.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.013