王健，魏丹，謝肄聰(天津醫(yī)科大學(xué)，天津30005;天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型的建立

王健1，魏丹1，謝肄聰2
(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300052;2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

摘要:目的采用大黃瀉下法復(fù)合改良線栓法建立氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型。方法50只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為A組(10只)、B組(10只)、C組(15只)、D組(15只)，A組不做處理，B組、D組提前灌胃大黃7 d，C、D組之后接受大腦中動脈阻塞術(shù)，B組僅做頸正中切口后縫合。觀察各組大鼠一般形態(tài)、血液流變學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)。結(jié)果D組大鼠被毛黯淡枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，雙眼淺紅、微睜、無神，精神萎靡，自主活動少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量增長緩慢，舌質(zhì)由淡紅轉(zhuǎn)為紫黯。與A、B、C組相比，D組血液流變學(xué)指標(biāo)水平高，EPCs數(shù)量少(P均＜0.05)。結(jié)論采用大黃瀉下法復(fù)合改良線栓法成功建立了氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型。

關(guān)鍵詞:腦血管疾病;大腦中動脈栓塞;氣虛血瘀證;血液流變學(xué);內(nèi)皮祖細(xì)胞

大鼠大腦中動脈線栓法誘導(dǎo)的大腦中動脈栓塞(MCAO)腦缺血模型［1］是研究局灶性腦缺血及缺血再灌注最常用的造模方法。目前，中醫(yī)藥治療腦血管疾病的機(jī)制研究多采用和借鑒MCAO模型。然而在中醫(yī)理論體系下，疾病的發(fā)生發(fā)展過程中病與證往往是同時(shí)存在的，所以簡單復(fù)制疾病動物模型或證候動物模型并不能滿足中醫(yī)藥研究對動物模型的需要。本研究采用大黃瀉下法復(fù)合改良線栓法模擬腦缺血再灌注損傷，旨在采用中西醫(yī)結(jié)合理論指導(dǎo)下的病證結(jié)合造模法，為臨床中西醫(yī)結(jié)合研究腦血管疾病的病理機(jī)制和機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量220～260 g，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，許可證號: SCXK(京) 2009-0017。

1.2主要試劑與儀器生大黃粉劑(深圳華潤三九醫(yī)藥貿(mào)易有限公司，批號: 1008172S) ;大鼠淋巴細(xì)胞分離液(美國Sigma公司) ; PE標(biāo)記兔抗鼠CD34(美國Santa Cruz Biotechnology) ; FITC標(biāo)記兔抗鼠CD133(北京博奧森生物技術(shù)有限公司) ; 0.01 mol/L PBS緩沖液、0.5% BSA緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。普利生全自動自清洗血流變儀(北京普利生集團(tuán)) ; LBY-N6B(德國Hereaus公司) ;流式細(xì)胞儀(FACSCalibur型，美國BD公司)。

1.3氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型的構(gòu)建方法及評價(jià)所有大鼠平衡飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為A組(10只)、B組(10只)、C組(15只)、D組(15只)，A組不做處理，B組、D組提前灌胃100%生大黃溶液(80℃水沖泡大黃超微粉后再80℃水浴5 min，自然冷卻后雙層紗布過濾，濃縮至100%，4℃冰箱保存，用時(shí)水浴至室溫［2］)，4 g/kg，灌胃7 d。C、D組之后根據(jù)參照文獻(xiàn)［1］方法建立MCAO模型，模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［1］，評分為2～4分則視為腦缺血再灌注模型構(gòu)建成功。B組僅做頸正中切口后縫合。參考扈新剛研究方法，觀察大鼠外貌、精神、活動、舌質(zhì)等判斷其是否出現(xiàn)氣虛血瘀證癥狀。術(shù)后24 h大鼠股靜脈剪開取血，枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝，檢測各項(xiàng)血液流變學(xué)指標(biāo);并采用郭新賓等［3］密度梯度離心法分離提取外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)CD34/CD133雙熒光標(biāo)記陽性細(xì)胞。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

A組大鼠被毛光亮整齊，爪甲顏色如常，雙目鮮紅、有神，活動自如，活潑好動，對外界刺激反應(yīng)靈敏; B組大鼠被毛黯淡且稍枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，雙目淺紅、有神，活動自如，自主活動減少，對外界刺激反應(yīng)靈敏; C組大鼠被毛黯淡枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，雙目淺紅、無神，自主活動少，對外界刺激反應(yīng)稍遲鈍; D組大鼠被毛黯淡枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，雙眼淺紅、微睜、無神，精神萎靡，自主活動少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍。B、C和D組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，甚至出現(xiàn)負(fù)增長。B組大鼠舌質(zhì)淡紅; C組大鼠造模后舌質(zhì)由淡紅轉(zhuǎn)為紫色; D組大鼠在造模后舌質(zhì)由淡紅轉(zhuǎn)為黯紫。各組最終均選取10只大鼠。各組大鼠血液流變學(xué)變化見表1、2。A、B、C、D組每20萬單位的EPCs數(shù)量分別為51.904±4.270、53.523±3.541、42.000±16.610、35.827±4.347，C、D組與A、B組比較，D組與C組比較，P均＜0.05。

表1　各組大鼠血液黏度比較(mPa·s，±s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與B組比較，▲P＜0.05;與C組比較，●P＜0.05。

組別　全血黏度(低切1/s)全血黏度(低切5/s)全血黏度(低切30/s)血漿黏度(高切200/s)全血高切還原黏度　全血高切相對指數(shù)A組　22.892±0.517　10.552±0.515　6.313±0.469　4.856±0.448　6.585±0.689　3.202±0.239 B組　23.432±0.713　10.263±0.527　6.014±0.341　4.328±0.381　6.371±0.382　3.127±0.216 C組　27.572±0.969＊▲　11.589±0.445＊▲　7.878±0.268＊▲　5.507±0.206＊▲　7.292±0.185＊▲　3.457±0.061＊▲D組　31.502±0.153＊▲●　13.609±0.315＊▲●　8.902±0.275＊▲●　6.263±0.847＊▲●　8.547±0.876＊▲●　3.983±0.034＊▲●

表2　各組大鼠血液紅細(xì)胞聚集性能比較(±s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與B組比較，▲P＜0.05;與C組比較，●P＜0.05。

組別　血沉(mm/h)　血沉方程k值　紅細(xì)胞聚集指數(shù)(mPa·s)　紅細(xì)胞剛性指數(shù)　紅細(xì)胞壓積(%) A組　2.364±1.531　22.388±3.754　4.103±0.362　4.342±0.386　40.01±0.632 B組　4.333±1.751　28.388±9.186　4.258±0.151　4.106±0.328　45.42±1.960 C組　6.836±0.659＊▲　35.152±5.273＊▲　4.738±0.315＊▲　5.103±0.251＊▲　50.67±1.03＊▲D組　7.010±1.265＊▲●　37.482±6.288＊▲●　4.891±0.185＊▲●　5.983±0.964＊▲●　52.31±3.276＊▲●

3　討論

急性腦血管疾病可歸為中醫(yī)學(xué)的“中風(fēng)”范疇。缺血性腦血管病中醫(yī)臨床分為肝陽暴亢、風(fēng)痰阻絡(luò)、痰熱腑實(shí)、陰虛風(fēng)動及氣虛血瘀5類證型，其中又以氣虛血瘀證所占比例最高［4］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇建立該證型腦缺血相關(guān)模型。多因素復(fù)合模型基于中醫(yī)藥理論，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)知識，分別或同時(shí)采用中醫(yī)學(xué)病因復(fù)制證候模型和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因復(fù)制疾病動物模型，使模型動物同時(shí)表現(xiàn)出疾病和證候的特征［5］。病證結(jié)合動物模型是指在傳統(tǒng)中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用六淫、飲食、情志、勞倦等中醫(yī)特有的致病因素建立中醫(yī)病因證候模型，在此基礎(chǔ)上通過藥物或手術(shù)等方法，建立西醫(yī)疾病的模型［6］，制造出既符合西醫(yī)疾病的特點(diǎn)又具有相應(yīng)的中醫(yī)癥候特征的復(fù)合型動物模型。病證結(jié)合動物模型更好地體現(xiàn)了疾病的特點(diǎn)，能夠更好地了解疾病的發(fā)展規(guī)律，從而更好地為中醫(yī)臨床實(shí)踐提供服務(wù)［7］。

本研究采用復(fù)合造模思路，選擇經(jīng)典的大鼠大腦中動脈線栓法建立MCAO腦缺血模型，大黃瀉下法造成氣虛血瘀證候，復(fù)合這兩種方法建立氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型。該模型的評價(jià)指標(biāo)由3方面組成:①根據(jù)參考文獻(xiàn)的研究方法觀察大鼠外貌、精神、活動、舌質(zhì)等變化。研究［8］表明，氣虛血瘀證大鼠會有精神萎靡，雙眼淺紅、微睜、無神，自主活動少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，被毛黯淡枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，舌質(zhì)由淡紅轉(zhuǎn)為黯紫等證候。本研究中D組出現(xiàn)氣虛血瘀證候，且比B組及C組嚴(yán)重。②在1986年第2屆全國活血化瘀研究學(xué)術(shù)會議上，血液流變學(xué)指標(biāo)變化正式被列為診斷血瘀證標(biāo)準(zhǔn)之一。有研究［9，10］報(bào)道，氣虛血瘀證大鼠的全血黏度、血漿黏度、血沉、血沉方程k值、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著增高。楊海燕等［11］研究發(fā)現(xiàn)，缺血性中風(fēng)氣虛血瘀型患者的全血黏度、全血還原黏度(低、高)、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原較健康人高。本實(shí)驗(yàn)D組血液流變學(xué)指標(biāo)較A組及C組增大，該結(jié)果與其他研究一致。③EPCs參與受損血管內(nèi)膜的再內(nèi)皮化，在維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用［12］; EPCs還可用于預(yù)測腦卒中后神經(jīng)功能損傷程度、預(yù)后及腦血管疾病的治療［13～15］;可作為判定腦損傷的標(biāo)準(zhǔn)之一。本實(shí)驗(yàn)氣虛血瘀證大鼠模型EPCs數(shù)量比正常大鼠少。且D組大鼠外周血EPCs數(shù)量較A組及C組減少，說明大鼠腦損傷程度嚴(yán)重。

本研究在使大鼠形成氣虛血瘀證的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行缺血再灌注處理，以達(dá)到中醫(yī)病證結(jié)合動物模型的要求，使模型鼠的發(fā)病過程更接近臨床的病理過程。這不僅保證了模型病、證的準(zhǔn)確性，同時(shí)較單純中醫(yī)證型造模方法的造模時(shí)間短，可靠性及穩(wěn)定性好，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了良好的模型基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1) :84-91.

［2］竇倩，謝肄聰.三種不同劑型大黃對大鼠瀉下作用的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2011，28(6) : 510-512.

通信作者:謝肄聰

基金項(xiàng)目:天津市衛(wèi)生局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研項(xiàng)目(11106)。

文章編號:1002-266X(2015)19-0025-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R743

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.008