陳 帥，趙延敏

( 1. 浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學(xué)，浙江 杭州 310035 )

科技與應(yīng)用

電子自旋共振技術(shù)(ESR)對(duì)魷魚氧化三甲胺熱促分解機(jī)理研究

陳 帥1，趙延敏2

( 1. 浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學(xué)，浙江 杭州 310035 )

利用電子自旋共振技術(shù)(ESR)從自由基的角度探究魷魚高溫氧化三甲胺(TMAO)熱分解的刺激因子的熱促分解機(jī)理，發(fā)現(xiàn)高溫條件下氨基酸和還原糖能明顯促進(jìn)魷魚中TMAO的熱分解，其中賴氨酸(Lys)和半乳糖(Gal)促進(jìn)作用最強(qiáng)，且魷魚上清和TMAO- Fe(II)在高溫條件下形成相似的自由基六重峰信號(hào)，Lys或Gal均能使魷魚上清中自由基信號(hào)增強(qiáng)，判定Lys和Gal通過增強(qiáng)-(CH3)3N·信號(hào)促進(jìn)TMAO熱分解產(chǎn)生FA。

魷魚；氧化三甲胺；甲醛；ESR

魷魚絲、烤魷魚片等魷魚制品因營養(yǎng)豐富、口味獨(dú)特、食用方便而深受廣大消費(fèi)者歡迎。然而，魷魚制品中高含量內(nèi)源性甲醛(Formaldehyde，F(xiàn)A)給產(chǎn)品品質(zhì)和食用安全帶來了負(fù)面的影響[1]。因此，探究魷魚制品中內(nèi)源性FA的高溫產(chǎn)生機(jī)理 已是當(dāng)務(wù)之急。研究已表明，水產(chǎn)品內(nèi)源性FA的前體物質(zhì)是氧化三甲胺(Trimethylamine-n-oxide, TMAO)。在加工過程中受到蒸煮、烘烤等高溫加熱工藝，TMAO熱分解產(chǎn)生FA、二甲胺(Dimethylamine, DMA)和三甲胺(Trimethylamine, TMA]。[1]Lin等發(fā)現(xiàn)5種魷魚在200°C 加熱 1h 90%的TMAO熱分解生成DMA和TMA。[2]Spinelli等報(bào)道魚體組織中的Fe2+, Sn2+, SO2和 半胱氨酸的代謝產(chǎn)物能顯著促進(jìn)TMAO的非酶分解。[3]李豐等[4]在研究乳糖與TMAO的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著乳糖用量增加和溫度升高，DMA、TMA和半乳糖的生成量增多。李薇霞等[5]在研究奶糖中FA的產(chǎn)生來源，發(fā)現(xiàn)FA產(chǎn)生與美拉德反應(yīng)中的Strecher降解有關(guān)?？梢?，魷魚中刺激TMAO分解生成DMA和FA的關(guān)鍵內(nèi)源性促進(jìn)因子，可能與氨基酸和還原糖等有關(guān)。

此外，F(xiàn)erris等在研究Fe2+對(duì)TMAO熱解的脫烷基作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，真正起到促進(jìn)其熱解作用產(chǎn)生FA的是Fe2+而不是Fe3+，而且主要是通過自由基(CH3)3N·的途徑來完成的，反應(yīng)過程如下：

(CH3)3NOH+Fe2+→(CH3)3N·+Fe3++H2O

(CH3)3N·+Fe2+→(CH3)3NH+Fe3+

(CH3)3N·+Fe3+→ (CH3)2N=CH2+H++Fe2+

+

H2O

↓

(CH3)2NH2+CH2O[6]

自由基的存在能大大加大化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞衰老及各種疾病的發(fā)生，而電子自旋共振技術(shù)(Electron spin resonance，ESR)廣泛的應(yīng)用于微量有基自由基的檢測，如檢測生物系統(tǒng)中HO·信號(hào)[7,8]，Steven等利用ESR技術(shù)檢測二甲亞砜被HO·氧化時(shí)產(chǎn)生的·CH3[9]；Ch. Kroll等利用ESR技術(shù)檢測生物醫(yī)藥品種硝酰基自由基[10]；賈佳在研究魷魚上清、鱈魚上清的自由基時(shí)，分別以PBN和DMPO作為捕獲劑，利用電子自旋共振技術(shù)(ESR)在加熱后的魷魚上清捕捉到明顯的六重峰，而且在TMAO-Fe2+體系中也檢測到相同的六重峰，從而推測得到的六重峰為-(CH3)3N·[11]；苗林林利用ESR技術(shù)，使用不同捕獲劑捕獲到類似的九重峰信號(hào)[12]，因此，推測魷魚中TMAO熱分解的一條可能途徑是通過-(CH3)3N·自由基來完成的。

本研究發(fā)現(xiàn)魷魚中TMAO熱分解產(chǎn)生FA、DMA和TMA的現(xiàn)象與氨基酸和還原糖變化有一定關(guān)聯(lián)；通過氨基酸和還原糖的體外添加試驗(yàn)，篩選出促進(jìn)魷魚上清、TMAO和TMAO-Fe(II)體系甲醛生成的因子賴氨酸和半乳糖，并從自由基角度闡述其促進(jìn)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

魷魚，浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司；TMAO、TMA、DMA純度98%，美國SIGMA公司；葡萄糖、半乳糖和乳糖，分析純，成都科龍化工試劑廠；HNO3，色譜純，上海阿拉丁試劑；三氯乙酸，純度99.5%，上海阿拉丁試劑；甲醇、乙腈，99.9%，美國TEDIA公司；甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液100mg/L，國家環(huán)?？偩帧?/p>

1.2 主要試驗(yàn)儀器

ICS-1500離子色譜儀，美國戴安公司；HPLC1100高效液相色譜配有Agilent ODS2-C18 柱及紫外檢測器，美國Agilent公司；SIGMA3-30K冷凍高速離心機(jī)，SIGMA公司；AB-135-S電子天平，梅特勒-托利多公司；PHS-3C pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Milli-Q Century超純水系統(tǒng)，美國密理博。

1.3 魷魚上清制備

冷凍魷魚室溫解凍后，將魚肉切小塊搗碎，取一定量碎魷魚，以1：2(g:V)與Tris-乙酸緩沖液(pH 7.0)混合，勻漿，離心(3000 g，12 min)，取上清液，沉淀以1：1緩沖液混合，勻漿，重復(fù)2次，上清(即提取的魷魚上清)混合，4℃冷藏備用。

1.4 樣品處理

取魷魚肉在100℃沸水浴中處理30min，冷卻，加入1ml 7.5%TCA，離心，取上清，測定TMAO、TMA、DMA、FA和還原糖含量。配置20mM TMAO和20mM TMAO-20mM Fe(II)的體外反應(yīng)體系，7種還原糖對(duì)魷魚上清、TMAO和TMAO-M Fe(II)體系FA生成的影響，具體處理方法是：分別取7中還原糖與魷魚上清、TMAO和TMAO-Fe(II)進(jìn)行等體積混合，還原糖作用濃度分別為20mM和200mM，以超純水為空白對(duì)照，于100℃反應(yīng)30min，同上處理后，測定FA含量。

1.5 TMAO、TMA、DMA和甲醛的檢測方法

采用離子色譜法測定樣品氧化三甲胺、三甲胺和二甲胺的含量[4]，參考李薇霞等[5]高效液相色譜法測定甲醛含量。

1.6 ESR檢測自由基

將0.5mL樣品置于2mL離心管，于100℃水浴15min，促使自由基產(chǎn)生，加入15mg PBN混勻，并于60℃保溫1h，取樣測定。ESR測定條件：室溫，中心磁場為3512.00G，微波功率為6.35mw，調(diào)制頻率為100GHz，調(diào)制幅度為2.00G，掃描40.96sec[11]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表達(dá)。采用Origin 8.0進(jìn)行作圖，SPSS軟件單因素方差分析(Analysis of variance，ANOVA)用來比較各組間的差異，P<0.05 表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫處理對(duì)魷魚肌肉和魷魚上清TMAO熱分解的影響

注：同一行中數(shù)據(jù)右上角字母不同表示顯著差異(P<0.05)。

魷魚肌肉和魷魚上清經(jīng)100℃加熱處理30min后，F(xiàn)A、DMA、TMA和TMAO含量變化如表1所示。高溫對(duì)魷魚肌肉和上清TMAO表現(xiàn)出相似的分解規(guī)律，TMAO含量表現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，相應(yīng)的FA、DMA含量顯著上升(P<0.05)，魷魚上清中TMA的變化較小，這與魷魚肌肉中可能存在其他的促進(jìn)TMA形成因素有關(guān)，如酶等。研究已表明，在高溫加熱過程中阿根廷和北太魷魚胴體中TMAO分解為TMA、DMA和FA。[2,3]李薇霞等[5]在研究奶糖中FA的產(chǎn)生來源，發(fā)現(xiàn)FA產(chǎn)生與美拉德反應(yīng)有關(guān)。由于高溫過程中可能存在美拉德反應(yīng)，因此推測甲醛產(chǎn)生可能與外源添加氨基酸和還原糖有關(guān)。

2.2 氨基酸、還原糖對(duì)魷魚上清和TMAO-Fe(II)水溶液中FA形成的影響

注：各組因素同一列中數(shù)據(jù)右上角字母不同表示顯著差異(P<0.05)；

分別研究3種氨基酸和3種還原糖對(duì)魷魚上清及TMAO-Fe(II)模擬體系高溫FA生成的影響如表2所示。結(jié)果可見，經(jīng)過100℃處理30min后，魷魚上清和TMAO-Fe(II)模擬體系甲醛生成明顯。其中賴氨酸和半乳糖能明顯提高甲醛的含量，分別由17.8 mg/L、8.82 mg/L上升至117.30mg/L、32.47 mg/L，而葡萄糖、乳糖、甘氨酸雖能促進(jìn)TMAO-Fe(II)模擬體系中FA的產(chǎn)生，但對(duì)魷魚上清的促進(jìn)作用不明顯。高濃度的半胱氨酸反而能抑制FA的產(chǎn)生，這可能是因?yàn)榘腚装彼崤c生成的FA結(jié)合。

2.3 ESR檢測TMAO和TMAO-Fe(II)中自由基信號(hào)

分別將TMAO標(biāo)準(zhǔn)品、TMAO+2mM Fe(II) 和TMAO+20mM Fe(II) 100℃加熱處理15min，其自由基信號(hào)如圖1所示，TMAO標(biāo)準(zhǔn)品中加入Fe2+能夠明顯提高自由基信號(hào)的強(qiáng)度，而且自由基信號(hào)為六重峰，當(dāng)Fe2+濃度由2mM增加至20mM時(shí)，自由基信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，由300000增加至1750000。J P Ferris等[6]發(fā)現(xiàn)Fe2+對(duì)TMAO的脫烷基化作用是通過-(CH3)3N·自由基產(chǎn)生甲醛，因此，此自由基信號(hào)應(yīng)為-(CH3)3N·自由基。

2.4 ESR檢測加熱處理后魷魚上清、魷魚上清-Lys/Gal中自由基信號(hào)

在同樣的ESR測定條件下，分別對(duì)魷魚上清、魷魚上清+賴氨酸和魷魚上清+半乳糖的自由基進(jìn)行檢測，測定結(jié)果如上圖所示，加熱處理過的魷魚上清產(chǎn)生了與TMAO-Fe(II)體系相同的明顯的六重峰自由基信號(hào)，強(qiáng)度為200000以上 ，因此魷魚上清中FA的產(chǎn)生同樣是通過-(CH3)3N·，添加賴氨酸或半乳糖后-(CH3)3N·信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，到達(dá)400000，因此可以判定賴氨酸和半乳糖的促進(jìn)機(jī)理與Fe2+對(duì)TMAO的脫烷基化作用相同，都是通過-(CH3)3N·完成。

3 結(jié)論

魷魚中氧化三甲胺高溫?zé)岱纸饽墚a(chǎn)生甲醛、二甲胺和三甲胺，美拉德反應(yīng)能促進(jìn)TMAO熱分解，其中以賴氨酸和半乳糖促進(jìn)作用最強(qiáng)，而且其熱促反應(yīng)機(jī)理與Fe2+對(duì)TMAO的脫烷基化作用相同，均是以提高-(CH3)3N·自由基的強(qiáng)度進(jìn)行的。

[1]Zhu, J. L., Li, J. R., & Jia, J. (2012). Effects of thermal process and various chemical substances on formaldehyde and dimethylamine formation in squid Dosidicus gigas[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 92, 2436-2442.

[2]Lin, J. K., & Hurng, D. C. (1985). Thermal conversion of trimethylamine-N-oxide to trimethylamine and dimethylamine in squids[J].Food and Chemical Toxicology, 23, 579 -583.

[3]Spinelli, J., & Koury, B. (1979). Nonenzymic formation of dimethylamine in dried fishery products[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 27, 1104-1108.

[4] 李豐. 水產(chǎn)品中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺檢測方法及魷魚絲中甲醛控制研究[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010:1-50.

[5] 李薇霞. 奶糖中內(nèi)源性甲醛生成機(jī)理研究[D]. 杭州: 浙江工商大學(xué), 2012:1-56.

[6] J P Ferris, R D Gerwe, G R Gapski. Detoxication Mechanisms.II.The Iron-Catalyzed Dealkylation of Trimethylamine Oxide[J]. Journal of the American Chemical Society, 1967, 89(27):5270-5275.

[7]王炳娟, 盧青, 鄒洪. 氣相色譜法測定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基及其清除作用[J]. 理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè), 2009, 45(1):88-90.

[8]李崎, 嚴(yán)敏, 李永仙等. 利用電子自旋共振(ESR)技術(shù)研究啤酒原輔料自由基及其對(duì)麥汁自由基的影響[J]. 分析試驗(yàn)室, 2007, 26(5):85-90.

[9]Steven Yue Qian, Maria B. Kadiiska, Qiong Guo, et al. A novel protocol to identify and quantify all spin trapped free radicals from in vitro/in vivo interaction of HO? and DMSO: LC/ESR, LC/MS,and dual spin trapping combinations[J]. Free Radical Biology & Medicine, 2005, 38:125-135.

[10]Ch. Kroll, K-H Schwarz, P Surmann, H-H Borchert. Differential pulse polarography and electron spin resonance spectroscopy of nitroxyl free radicals used as ESR-spin probes[J]. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1999, 48:233-236.

[11]賈佳. 秘魯魷魚中氧化三甲胺熱分解生成甲醛和二甲胺機(jī)理的初步研究[D]. 杭州: 浙江工商大學(xué), 2009:6-61.

[12]苗林林. 秘魯魷魚復(fù)合甲醛抑制劑的研發(fā)及其應(yīng)用[D]. 杭州: 浙江工商大學(xué), 2011: 1-56.

(責(zé)任編輯：孫強(qiáng))

Study on the Thermal Degradation of TMAO in Squid by Electron Spin Resonance(ESR)

CHEN Shuai1,ZHAO Yan-min2

( 1.Zhejiang Yuying Collage of Vocational Technology, Hangzhou, Zhejiang 310018, China;2. Zhejiang Gongshang University, Hangzhou, Zhejiang 310035, China )

To assess the stimulatory factor of TMAO breakdown, the influence of reducing sugar to the thermal conversion of trimethymine-N-Oxide (TMAO) to formaldehyde (FA) in squid was studied. It showed that the correlation of decomposition of TMAO and reducing sugar was observed. The galactose exhibited the strongest stimulatory factor in formation of FA in the squid extract and TMAO aqueous solution. The similar promotion of the degradation of TMAO to FA, DMA and TMA was observed in two systems. The addition of Lys and Gal enhanced greatly the signal intensity in the squid extract. Therefore, Lys and Gal could promote the conversion of TMAO to FA by enhancing the signal strength of -(CH3)3N· in squid.

squid; trimethymine-N-Oxide (TMAO); galactose; formaldehyde (FA); ESR

2014-09-01

浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)課題(YYFW1301)

陳帥(1987- )，女，山東濰坊人，碩士，食品教研室助教。

TS207.4

A

1671-4385(2015)01-0089-04