王海軍

(齊齊哈爾醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經內一科，黑龍江，齊齊哈爾 161041)

黃芩苷對腦缺血后大鼠海馬COX-2表達和神經干細胞增殖作用及其可能機制*

王海軍

(齊齊哈爾醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經內一科，黑龍江，齊齊哈爾 161041)

目的:探究黃芩苷對大鼠全腦缺血/再灌注損傷后動物行為學、內源性神經干細胞再生數量以及COX-2(環(huán)氧化酶-2)蛋白表達量的影響，分析其可能的作用機制。方法:84只體質量250～300 gWistar大鼠按隨機數字表法分為3個實驗組(n=28):假手術組(Sham)，全腦缺血/再灌注后黃芩苷胃灌注處理組(Baicalin)，全腦缺血/再灌注后生理鹽水胃灌注處理組(Saline-water)。參照Pulsinelli法建立全腦缺血/再灌注損傷大鼠模型，通過Bederson神經癥狀分級評分、被動回避實驗、免疫組織化學檢測、蛋白免疫印跡實驗分別檢測黃芩苷對模型大鼠神經功能損傷、學習記憶能力、內源性神經干細胞增殖數量以及COX-2蛋白表達變化的影響。結果:與假手術組(Sham)比較，Baicalin組與Saline-water組大鼠神經功能障礙癥狀都更加明顯且差異顯著;大鼠進入暗室的潛伏期均縮短，錯誤次數均明顯增多;海馬腦區(qū)5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)陽性細胞數均顯著增加;腦組織環(huán)氧合酶-2(COX-2)蛋白的表達顯著增加。與Saline-water組比較，Baicalin組大鼠經黃芩苷胃灌注干預，神經功能損傷顯著改善，潛伏期顯著延長，錯誤次數顯著減少;Baicalin組海馬腦區(qū)Brdu陽性細胞數顯著多于Saline-water組，Baicalin組COX-2蛋白的表達水平較Salinewater組明顯降低。結論:黃芩苷對大鼠全腦缺血/再灌注損傷具有顯著保護作用，其機制可能是通過降低COX-2基因表達、抑制損傷伴隨炎癥反應，從而改善內源神經干細胞小生境(niche)，促進內源性神經干細胞的增殖或存活率。

黃芩苷;神經功能;被動回避實驗;內源性神經干細胞;環(huán)氧化酶-2

目前，不論是局部還是全局腦部停循環(huán)引發(fā)的腦缺血，都是我國成年人的主要致死致殘因素。行使學習與記憶的海馬腦區(qū)常常是腦缺血后最早也是最嚴重的受損區(qū)域［1-2］。腦缺血早期能觀察到海馬腦區(qū)神經元死亡、突觸連接改變，以及多種基因和蛋白表達變化，這種腦缺血后腦組織分子生物學和結構的改變，往往會反映為病人的認知功能減退、失明、感覺異常，嚴重者甚至會引發(fā)肢體無力或癡呆［1］。目前臨床尚無有效的治療手段，故尋找可行性治療手段的基礎研究方向，主要為尋找神經保護劑，對神經元及其功能進行保護和干細胞療法［2］。

關于尋找神經保護劑類新型藥物的研究很多，其中抑制炎癥反應的藥物研究是一個熱點。這是因為腦缺血常常伴隨有明顯的炎癥反應。臨床前研究也表明，炎癥干預可有效減緩腦缺血后期腦損傷的進展［3-4］。環(huán)氧化酶-2為誘生型環(huán)氧化酶，是炎性反應的標志物，也是腦缺血導致神經元死亡的關鍵酶。研究發(fā)現，腦缺血后誘發(fā)COX-2表達與缺血后損傷有密切關系［5］。此外，COX-2對神經干細胞的增殖活動也有一定程度影響［6］。目前的主要假說是，COX-2基因表達下調可以抑制炎癥反應，從而改善內源神經干細胞小生境(niche)，促進內源性神經干細胞的增殖或提高其存活率。干細胞移植作為療法應用于腦缺血的研究歷史還比較短暫，目前主要包括移植外體干細胞和激活內體神經干細胞［7］。由于激活內體神經干細胞有明顯的安全性和操作簡單、風險低的優(yōu)勢，故如何激活內體干細胞以增加新生神經元的數量成為近年的研究熱點。有研究發(fā)現，腦缺血可以激發(fā)成年腦神經干細胞增殖［8］，如果結合藥理學的干預，增加內體神經干細胞再生，補償缺血后死亡腦神經元細胞的功能，就有可能為臨床缺血后腦血管意外事件治療提供可行性指導。

黃芩為中國傳統中藥材，《神農本草經》最早描述其具有清熱燥、瀉火毒等功效。黃芩苷(Baicalin)是黃芩提取物的主要活性成分，現代藥理研究表明其具有殺菌、抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用［9］。最近的研究還表明，黃芩苷有神經保護、在體外促進細胞增殖、誘導細胞分化作用，這點提示我們黃芩苷可能在腦缺血后損傷修復治療中扮演重要角色［10-12］。

因此，本實驗模擬臨床上腦組織缺血/再灌注損傷，在大鼠中建立全腦缺血/再灌注模型，觀察黃芩苷對腦缺血后大鼠腦損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和實驗分組

雄性Wistar大鼠由本院實驗動物中心提供，84只體質量250～300 g大鼠按隨機數字表法分為假手術組(Sham)、全腦缺血/再灌注后黃芩苷胃灌注處理組(Baicalin)、全腦缺血/再灌注后生理鹽水胃灌注處理組(Saline-water)各28 d［13］。手術后，10只用于行為學分析，18只用于蛋白表達(術后第2天)和神經干細胞增殖的檢測(術后第2、4、8天)。

1.2 實驗方法

1.2.1 各組大鼠處理方法 Baicalin組參照Pulsinelli法，建立全腦缺血 15 min后再灌流模型［14］，模型建立后對大鼠進行黃芩苷灌胃藥理干預(模型建立后持續(xù)3 d，每日1次，劑量100 mg/kg)。Saline-water組模型建立同Baicalin組，模型建立后對大鼠進行生理鹽水灌胃藥理干預(模型建立后持續(xù)3 d，每日 1次，劑量 100 ml/kg)。假手術組(Sham)不進行雙側總動脈夾閉操作，其余步驟相同Saline-water組。

1.2.2 樣本采集與實驗檢測方案 每組按隨機數字表法選取18只大鼠，分別在建模后第2天、第4天、第8天處死，每次處死6只。取第2天處死大鼠腦組織，蛋白免疫印跡實驗測定大鼠海馬COX-2的表達變化。免疫組化檢測海馬齒狀回(Dentate gyrus，DG)BrdU陽性細胞的表達(20 mg/ ml BrdU生理鹽水注射液腹腔注射)。

1.2.3 模型大鼠神經功能指標測定 在第1、3、5天采用Bederson神經癥狀分級，對每組模型大鼠進行評分。0分:對大鼠提尾無癥狀;1分:對大鼠提尾，體態(tài)為損傷對側前肢不能伸直;2分:對大鼠提尾，體態(tài)為損傷對側前肢屈曲，未見轉圈行為;3分:對大鼠提尾，體態(tài)為損傷對側前肢屈曲，伴自發(fā)轉圈行為［15］。

1.2.4 模型大鼠被動回避實驗測定 手術后第1、2、3、4天每組按隨機數字表法選取10只大鼠，每日3次被動回避訓練實驗。XBA-2大鼠避暗程序自動控制儀由一個暗室和一個明室組成，有通道連接，暗室可對大鼠電擊。從面朝暗室放入大鼠開始計時，直到第1次電擊時間記錄為潛伏期，電擊后返回明室記錄為1次錯誤次數。電腦記錄5 min內的潛伏期和錯誤次數。手術后第5天進行被動回避記憶實驗，取消暗室的電擊，記錄大鼠潛伏期(第1次)和錯誤次數(5 min內)［16］。

1.3 統計學方法

實驗組內不同時間點的比較采用方差分析，2組之間同一時間點的比較采用t檢驗。描述性數據以均數±標準差(±s)表示;動物行為實驗結果用Med Associates軟件分析，在被動回避實驗訓練中超過100 s未進入黑暗箱探索的動物視為無效數據，未計入最后數據統計。所有數據采用IBM公司SPSS 19.0軟件處理，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩苷對全腦缺血/再灌注損傷大鼠神經功能的影響

表1圖1顯示，由不參與大鼠分組的實驗員對各組大鼠神經行為學進行評估，各組在第1、3、5天計算評分結果。從結果可以看出，與Sham組比較，第1、3、5天Baicalin組與Saline-water組大鼠神經功能障礙癥狀都更加明顯，差異有統計學意義(P= 0.000，P=0.000)。但隨著術后時間的增加，各組分值都逐漸下降，癥狀都有所改善。第1天Baicalin組大鼠神經功能評分與Saline-water組比較差異無統計學意義。第3天、第5天Baicalin組大鼠神經功能評分明顯低于Saline-water組，且差異有統計學意義(t=3.162，P=0.005;t=3.796，P=0.001)。

2.2 黃芩苷對全腦缺血/再灌注損傷大鼠學習記憶能力的影響

各組被動回避訓練實驗記錄結果顯示(表2、圖2、表3、圖3)。表3顯示，手術后1～4 d每日被動回避訓練結果表明，全腦缺血/再灌注手術明顯引發(fā)大鼠學習記憶功能障礙。第2天訓練結果表明，與假手術組比較，Saline-water組和Baicalin組大鼠進入暗室的潛伏期均縮短(P=0.032，P=0.045)，錯誤次數均明顯增多(P=0.027，P=0.125)。但隨著訓練時間的延長，各組的平均潛伏期均縮短，且Sham組和Baicalin組4個時間點的平均潛伏期縮短程度顯著，Saline-water組不顯著(Sham組:F= 18.395，P=0.000;Saline-water組:F=2.656，P= 0.063;Baicalin組:F=9.841，P=0.000);各組4個時間點的錯誤次數均減少顯著(Sham組:F= 38.19，P=0.000;Saline-water組:F=7.757，P= 0.000;Baicalin組:F=10.82，P=0.000)。表3顯示，第5天被動回避記憶實驗結果表明，相比于Saline-water組，Baicalin組潛伏期顯著延長(t= 2.284，P=0.028)，錯誤次數顯著減少(t=4.427，P =0.000)。

表1 黃芩苷對缺血/再灌注大鼠神經功能的影響(±s)

表1 黃芩苷對缺血/再灌注大鼠神經功能的影響(±s)

注:與sham組比較:*P＜0.05:＊＊P＜0.01;與 Saline-water組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組 別 鼠數Score day 1 day 3 day 5 Sham 10 2.9±0.6 2.3±0.4 2.3±0.7 Saline-water 10 4.2±0.6＊＊ 4.0±0.3＊＊ 3.7±0.5＊＊Baicalin 10 4.0±0.3＊＊ 3.5±0.4＊＊ΔΔ 3.0±0.3＊＊ΔΔ

圖1 黃芩苷對缺血/再灌注大鼠神經功能的影響(±s，n=10)

2.3 黃芩苷對全腦缺血/再灌注大鼠海馬區(qū)內源性神經干細胞增殖的影響

表5圖4、5顯示免疫組化檢測模型大鼠海馬齒狀回(DG)區(qū)Brdu陽性細胞結果，假手術組(Sham)僅見少量Brdu陽性細胞，隨術后時間增長未見陽性細胞增加;表5、圖4、5顯示，術后第4天模型大鼠的組化結果顯示，Baicalin組及 Saline-water組的Brdu陽性細胞數與假手術組比較均顯著增加(P= 0.002，P=0.000)，且Baicalin組的Brdu陽性細胞數顯著多于Saline-water組(P=0.000)。術后第8天免疫組化結果表明，各組Brdu陽性細胞相比于第4天有所減少，但 Baicalin組及 Saline-water組的Brdu陽性細胞數差異仍顯著(P=0.004)。

表2 各組大鼠的逃避潛伏期(±s)

表2 各組大鼠的逃避潛伏期(±s)

注:與 sham組比較:*P＜0.05:＊＊P＜0.01;與 Saline-water組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組 別 鼠數day 1 day 2 day 3 day4 Sham 10 32±11.43 48±11.72 58±14.42 77±17.20 Saline-water 10 33± 9.50 37± 8.50*40±10.3* 44± 7.60＊＊Baicalin 10 32± 5.44 38± 7.20* 43±15.40*Δ55± 8.30＊＊ΔΔ

圖2 各組大鼠的逃避潛伏期(±s，n=10)

表3 各組大鼠的錯誤次數(±s)

表3 各組大鼠的錯誤次數(±s)

注:與 sham組比較:*P＜0.05:＊＊P＜0.01;與 Saline-water組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組 別 鼠數day 1 day 2 day 3 day4 Sham 10 5.8±1.20 3.0±1.42 1.90±0.72 1.3±0.44 Saline-water 10 5.5±1.62 4.7±1.77* 3.9±0.50＊＊ 2.8±0.92＊＊Baicalin 10 5.0±1.35 4.2±1.42 3.5±1.25* 2.0±0.77*Δ

圖3 各組大鼠的錯誤次數(±s，n=10)

表4 各組大鼠記憶測試的潛伏期和錯誤次數(±s)

表4 各組大鼠記憶測試的潛伏期和錯誤次數(±s)

注:與sham組比較:*P＜0.05:＊＊P＜0.01;與 Saline-water組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組 別 鼠數Item escape latency error time Sham 10 80±13.2 1.3±0.4 Saline-water 10 52±10.6＊＊ 2.9±0.3＊＊Baicalin 10 65±13.6＊＊Δ 2.2±0.4＊＊ΔΔ

2.4 黃芩苷對模型大鼠海馬區(qū)COX-2蛋白表達變化的影響

圖6、7顯示，手術后第 2天，Baicalin組及Saline-water組COX-2蛋白的表達與假手術組比較顯著增加(P=0.001，P=0.000)。黃芩苷灌胃后，Baicalin組 COX-2蛋白的表達水平較 Saline-water組明顯降低(P=0.016)。

表5 BrdU標記術后大鼠在海馬齒狀區(qū)的增殖細胞數

圖4 BrdU標記術后大鼠在海馬齒狀區(qū)的增殖細胞數

圖5 BrdU標記術后第4天模型大鼠在海馬齒狀區(qū)的增殖細胞(×200)

圖6 免疫印跡檢測術后第2天模型大鼠海馬COX-2蛋白表達

3 討論

圖7 免疫印跡檢測術后第2天模型大鼠海馬COX-2蛋白表達

藥理學研究明確了黃芩中活性成分黃芩苷具有抗炎、抗氧化、神經系統保護等作用［17］。石田寅夫等［18］用黃芩苷處理Wistar大鼠缺氧星形膠質細胞后，能促進神經前體細胞的遷移，說明黃芩苷具有促進神經分化的潛在能力。上述信息提示我們，黃芩苷對腦缺血所致腦組織損傷及病理變化可能有良好的干預作用。因此，本實驗建立了全腦缺血/再灌注大鼠模型，探討黃芩苷胃灌注模型大鼠是否對全腦缺血/再灌注造成的腦損傷具有保護作用，并具體探討黃芩苷是否對腦損傷后的大鼠動物行為和內源性神經干細胞增殖有影響。

全腦缺血/再灌注手術通常都會造成不同等級的神經功能損傷，主要損傷部位一般為海馬區(qū)，其主要表現是以記憶力下降為主的認知和學習功能障礙［2］。因此，本研究首先對各組模型大鼠神經行為學進行評估，結合被動避害實驗探討黃芩苷對腦缺血損傷大鼠的神經功能和學習記憶能力是否有改善作用。動物行為學評估結果表明，與Sham組比較，Baicalin組與Saline-water組大鼠神經功能障礙癥狀都更加明顯，差異有統計學意義(P=0.000，P= 0.000)，表明手術過程造成了顯著的腦損傷。第3天、第5天Baicalin組大鼠神經功能評分明顯低于Saline-water組，差異有統計學意義(t=3.162，P= 0.005，t=3.796，P=0.001)，提示黃芩苷胃灌注對腦損傷有干預作用。被動避害訓練實驗發(fā)現，Saline-water組和Baicalin組大鼠進入暗室的潛伏期均縮短(P=0.032;P=0.045)，錯誤次數均明顯增多(P=0.027;P=0.125)，表明腦缺血對大鼠的神經功能和學習能力造成顯著傷害。但隨著訓練時間的延長，各組的平均潛伏期均縮短，且Sham組和Baicalin組4個時間點的平均潛伏期縮短程度顯著，Saline-water組不顯著(Sham組:F=18.395，P= 0.000;Saline-water組:F=2.656，P=0.063;Baicalin組:F=9.841，P=0.000);各組4個時間點的錯誤次數均減少顯著(Sham組:F=38.19，P=0.000; Saline-water組:F=7.757，P=0.000;Baicalin組:F =10.82，P=0.000)。以上結果提示，黃芩苷胃灌注對腦缺血再灌注腦損傷大鼠所致神經功能障礙和學習記憶功能障礙有一定的保護作用。這種保護作用可能來源于黃芩苷能夠更好地刺激腦損傷后內源性神經干細胞的增殖，促進新生神經元的產生，使得受損傷的神經元功能獲得補償。

為探討黃芩苷是否能夠促進腦缺血損傷大腦內源性神經干細胞的增殖，本研究采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)腹腔注射，標記手術后第2、4、6天后大鼠海馬DG區(qū)新生的神經干細胞數量。假手術組(Sham)僅見少量 Brdu陽性細胞;術后第4天模型大鼠的組化結果顯示，Baicalin組及Saline-water組的Brdu陽性細胞數與假手術組比較均顯著增加(P =0.002)，且Baicalin組Brdu陽性細胞數顯著多于Saline-water組(P=0.000)。術后第8天免疫組化結果表明，各組Brdu陽性細胞相比于第4天有所減少，但Baicalin組及Saline-water組的Brdu陽性細胞數差異仍顯著(P=0.004)。本實驗結果表明，黃芩苷灌胃促進了腦缺血損傷后海馬腦區(qū)神經干細胞的新生。國外研究發(fā)現，COX-2蛋白的表達可能與抑制神經干細胞的新生、降低再生細胞的存活率機制有關［8，19-20］。為探討本實驗中海馬腦區(qū)神經干細胞新生受促進的可能機制，本研究采用免疫印跡法檢測了術后第2天腦組織COX-2蛋白表達水平。結果顯示，Baicalin組及Saline-water組COX-2蛋白表達與假手術組比較顯著增加(P=0.001;P= 0.000)，黃芩苷灌胃后，Baicalin組COX-2蛋白的表達水平較Saline-water組明顯降低(P=0.016)。結合本實驗假設和實驗結果，黃芩苷可能是通過抑制全腦缺血/再灌注損傷后COX-2蛋白的表達，抑制炎癥反應的發(fā)生，從而改善海馬腦區(qū)神經干細胞再生的環(huán)境。這種環(huán)境改善可能進一步激發(fā)了神經干細胞的再生，使得新生神經元數量增加，補償了損傷神經元的功能，從而起到神經保護的作用。

綜上所述，本研究在建立全腦缺血/再灌注大鼠模型后，通過胃灌注黃芩苷對模型大鼠進行干預發(fā)現，黃芩苷對全腦缺血/再灌注大鼠具有明顯的神經保護作用，具體表現為可以改善模型大鼠的神經功能損傷和認知功能障礙，提高學習記憶能力，增加內源性海馬區(qū)新生神經干細胞的數量。由于在腦損傷模型建立后，很快出現COX-2表達升高，且Salinewater組明顯高于Baicalin組。提示我們黃芩苷可能是通過降低腦損傷后COX-2的表達來抑制炎癥發(fā)生。新生干細胞數量增加可能源于炎癥反應受抑制，神經干細胞小生境得到改善，從而表現為模型大鼠的神經功能障礙和認知能力損傷得到改善。但本實驗設計尚有不足之處，未涉及黃芩苷給藥劑量和時效研究;未能系統探討黃芩苷對新生干細胞的遷移、分化及長期存活狀況的影響;不確定黃芩苷是僅僅促進了內源干細胞的新生，還是同時也增加了新生干細胞存活率，還是兩者兼有。本實驗結論仍需進一步探究。

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Effect of Baicalin on COX-2 Expression and Proliferation of Meural Stem Cells in Hippocampus of Rats after Cerebral Ischemia and Its Possible Mechanism

WANG Hai-Jun
(No.1 afficiated Hospital，Qiqiha'er Medical College，Qiqiha'er 161041，China)

To investigate the effects of baicalin on animal behavior，proliferation of endogenous neural stem cells and COX-2 gene expression in hippocampus of rats after global cerebral ischemia/reperfusion injury and the probable mechanism involved.Methods:Eighty-four Wistar rats weighting 250-300 g were randomized into three experimental groups (n=28):Sham operation group(Sham);Intragastric administration of Baicalin after global cerebral ischemia/reperfusion surgery group(Baicalin);Intragastric administration of Saline-water after global cerebral ischemia/reperfusion surgery group(Saline-water).Model of global cerebral ischemia/reperfusion was established according to Pulsinelli method.Bederson neurological grading score system，passive avoidance test，immunohistochemistry analysis，western blot analysis were used to detect the effects of baicalin on rat neurological function，learning and memory capacity，endogenous neural stem cell proliferation as well as the protein expression of COX-2 after surgery.Results:Compared with the Sham group，the improvement of neurological dysfunction of rats in Baicalin group and Saline-water group were more pronounced，and the difference was significant;escape latency were shorter，number of errors were significantly increased;the number of Brdu positive cells in the hippocampus were significantly increased;expression of COX-2 protein was significantly increased in rat brain tissue.Compared with Saline-water group，intragastric administration Brdu in Baicalin group significantly improved the neurological damage;escape latency was significantly increased and also significantly reduced the number of errors;The number Brdu positive cells in Baicalin group was significantly higher than that in Saline-water group;expression of COX-2 protein in Baicalin group was significantly lower.Conclusions:Baicalin has a significant protective effect on global cerebral ischemia/reperfusion injury in rats，which may be related with reducing the COX-2 gene expression.The inhibition of inflammation，thereby，improved the endogenous neural stem cell niche，promoted the proliferation or survival rate of endogenous neural stem cells

Baicalin;Neurological dysfunction;Passive avoidance test;Endogenous neural stem cells;COX-2

R285.5

B

1006-3250(2015)06-0660-05

2015-04-26

黑龍江省教育廳科研項目(12531825)

王海軍(1975-)男，黑龍江安達人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事神經病學的臨床與研究。