袁展紅 周日東 吳燦權(quán) 劉綺明

軍團(tuán)菌廣泛存在于各種天然和人工水環(huán)境中，其中嗜肺軍團(tuán)菌是引起非典型肺炎的重要病原菌，具有極強(qiáng)的傳染性和較高的病死率，嚴(yán)重危害人類的健康和生命安全，已成為世界性的公共衛(wèi)生問題；嗜肺軍團(tuán)菌在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，它主要是通過建筑物的水系統(tǒng)進(jìn)行傳播，感染該菌后發(fā)病速度快，死亡率高，我國(guó)自1982年在南京首次證實(shí)軍團(tuán)病以來，已有資料證實(shí)軍團(tuán)菌污染冷卻水與軍團(tuán)菌病的暴發(fā)密切相關(guān)[1]。2003年衛(wèi)生部《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》中明確規(guī)定在空調(diào)冷卻水中不得檢出軍團(tuán)菌[2]。冷卻水中軍團(tuán)菌傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)采用細(xì)菌培養(yǎng)、生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定等方法，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，易受水中雜質(zhì)和其他微生物的干擾，檢測(cè)結(jié)果的時(shí)效性和準(zhǔn)確性難以滿足疫情控制的需求，而實(shí)時(shí)熒光PCR法因其操作簡(jiǎn)便、快速可靠、抗污染性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸得到廣泛應(yīng)用。本次研究就冷卻水中嗜肺軍團(tuán)菌傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 主要儀器 Opticon 2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)MJ Research公司），多功能智能厭氧系統(tǒng)（荷蘭MART公司），Microfic微檢過濾系統(tǒng)（美國(guó)Minipore公司）。

1.2 主要試劑 軍團(tuán)菌診斷血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社和天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司，GVPC、BCYE、BCYECyS瓊脂平板購(gòu)自某公司，嗜肺軍團(tuán)菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自某公司，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 水樣采集 抽取某市范圍的集中空調(diào)冷卻水，以滅菌玻璃瓶采集500 mL水樣，采樣后立即送實(shí)驗(yàn)室當(dāng)天檢驗(yàn)。

1.4 方法

1.4.1 軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)與鑒定 按照衛(wèi)生部《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范 附錄A》（2013）的要求進(jìn)行軍團(tuán)菌檢測(cè)[3]。

1.4.2 傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法 （1）水樣處理：將水樣預(yù)處理后通過孔徑0.45 μm濾膜過濾，取下濾膜置于滅菌水中，充分洗脫，備用。（2）熱處理：取1 mL洗脫樣品置50 ℃水浴加熱30 min。（3）酸處理：取2 mL洗脫樣品調(diào)pH至2.2搖勻放置5 min。（4）分離培養(yǎng)：將不處理和經(jīng)處理的樣品各0.1 mL分別接種GVPC瓊脂平板，置于35~37 ℃、2.5% CO2培養(yǎng)1~10 d，每天觀察菌落生長(zhǎng)情況。（5）軍團(tuán)菌的鑒定：凡是在GVPC瓊脂平板上48 h后生長(zhǎng)，菌落呈灰白色、圓形稍凸、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)、毛玻璃狀，挑起似牙膏狀，可初步確定為可疑菌落[4]。挑取可疑菌落接種BCYE和BCYE-CyS瓊脂平板，35~37 ℃培養(yǎng)2 d，凡在BCYE瓊脂平板生長(zhǎng)而在BCYE-Cys瓊脂平板不生長(zhǎng)的菌落可初步認(rèn)定為軍團(tuán)菌，再通過革蘭氏染色涂片鏡檢、生化試驗(yàn)、血清凝集試驗(yàn)鑒定軍團(tuán)菌。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光PCR測(cè)定 （1）樣品處理：取待測(cè)樣品1 mL加到1.5 mL無菌離心管中，8000 rpm離心5 min，棄上清，加入50 μL提取液，混勻后水浴5 min，13 000 rpm離心5 min，吸取上清液進(jìn)行PCR檢測(cè)。（2）PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為25 μL，包括DNA模板2 μL，PCR反應(yīng)液22.5 μL，混合酶液0.5 μL[5]。反應(yīng)條件設(shè)為第1步：37 ℃ 5 min，95 ℃3 min，1 個(gè)循環(huán)；第 2 步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40 個(gè)循環(huán)。FAM通道采集熒光信號(hào)。（3）結(jié)果判定：熒光定量PCR檢測(cè)圖見圖1，熒光定量PCR檢測(cè)以Ct值<37且擴(kuò)增曲線呈S型為陽(yáng)性判定原則，其中，樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值<35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，可直接判定為陽(yáng)性；若樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值35~37值，需重復(fù)檢測(cè)，若兩次實(shí)驗(yàn)均得到良好的S型擴(kuò)增曲線則應(yīng)判定為陽(yáng)性[6]。

圖1 熒光定量PCR檢測(cè)圖

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用（x-±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果 64份冷卻水通過培養(yǎng)法檢出嗜肺軍團(tuán)菌8株，陽(yáng)性率為12.50%，同時(shí)有14株有可疑菌落生長(zhǎng)，通過實(shí)時(shí)熒光PCR法做進(jìn)一步鑒定。對(duì)培養(yǎng)法分離出的8株嗜肺軍團(tuán)菌和14株有可疑菌株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定時(shí)，結(jié)果顯示22株均為嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率為34.38%，兩種檢測(cè)方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=9.389，P<0.05）。

2.2 軍團(tuán)菌血清型分布 分離的22株嗜肺軍團(tuán)菌中，血清型分布以LP1為主，占菌株總數(shù)的68.18%（15/22），其次是LP3占菌株總數(shù)的13.64%（3/22），LP5和LP8各2株，LP6 1株。其中一份樣品同時(shí)存在2種血清型（LP5和LP6）。

3 討論

目前，軍團(tuán)菌已知有52個(gè)種，70多種血清型，能引起人類疾病的有20多種[7-8]。嗜肺軍團(tuán)菌是引起軍團(tuán)菌病的重要病原體，已發(fā)現(xiàn)15種血清型[9]。軍團(tuán)菌檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法。培養(yǎng)法是水軍團(tuán)菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法，軍團(tuán)菌生長(zhǎng)條件苛刻，要求特殊培養(yǎng)基，生長(zhǎng)速度緩慢，活的不可培養(yǎng)軍團(tuán)菌的存在以及其他菌種在培養(yǎng)基上的過度生長(zhǎng)影響培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求比較高，不能作快速鑒定。利用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)環(huán)境樣品中嗜肺軍團(tuán)菌，檢測(cè)時(shí)間快，但PCR檢測(cè)程序沒有標(biāo)準(zhǔn)化，容易受樣品中和前處理PCR抑制劑，核酸擴(kuò)增過程中引物和探針選擇等因素影響，產(chǎn)生一定假陰性和假陽(yáng)性[10]。

將培養(yǎng)法分離的陽(yáng)性菌株及可疑陽(yáng)性菌株用實(shí)時(shí)熒光PCR法予以驗(yàn)證，結(jié)果均為陽(yáng)性，隨著培養(yǎng)基配方的改進(jìn)，樣品前處理技術(shù)的發(fā)展，培養(yǎng)法分離軍團(tuán)菌的靈敏度有所提高。朱兵清等[11-12]研究表明，在BCYE-a培養(yǎng)基中添加合適的抗生素可有效抑制環(huán)境水樣中的雜菌，提高嗜肺軍團(tuán)菌的分離率。培養(yǎng)法具有不可替代的優(yōu)點(diǎn)，如發(fā)現(xiàn)新菌種等[13]。隨著實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)方法敏感性和特異性會(huì)相應(yīng)提高。培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，將對(duì)軍團(tuán)菌污染早期預(yù)警具有重要作用。

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