沈艷華 王亞娟 姚開虎 高 薇 丁翊君 吳 丹 董 方

?

·論著·

住院新生兒大腸埃希菌分離株毒力因子研究

沈艷華1王亞娟1姚開虎2高 薇2丁翊君1吳 丹1董 方3

目的 了解住院新生兒大腸埃希菌毒力因子的攜帶情況。方法 收集2009年9月至2012年5月臨床診斷為新生兒肺炎、敗血癥的連續(xù)病例，選擇其中抗生素使用之前痰液、血液、腦脊液或臍分泌物培養(yǎng)為大腸埃希菌的病例。根據(jù)發(fā)病日齡不同，將菌株分為早發(fā)型及晚發(fā)型。根據(jù)標本來源不同，將菌株分為侵襲性感染和非侵襲性感染。選取11種最常見的毒力基因，應用PCR方法對大腸埃希菌菌株進行檢測。采用Chromas軟件進行讀序，測序結果采用Chromas軟件直接進行BLAST Search比對。結果 110株大腸埃希菌分離自102例住院新生兒，源于痰液79株(71.8%)，血液18株(16.4%)，腦脊液6株(5.4%)，臍分泌物7株(6.4%)；源于足月兒102株，早產兒8株。早發(fā)型27株，晚發(fā)型83株；侵襲性感染24株，非侵襲性感染86株。①Einv基因陽性91.8%，CNF1基因陽性21.8%，CNF2基因陽性12.7%，Eagg基因0.9%；共有7種毒力基因攜帶模式：單純攜帶Einv基因66株，單純攜帶CNF1基因1株，攜帶Einv-CNF1基因20株，攜帶Einv-CNF2基因11株，攜帶Einv-CNF1-CNF2基因3株，攜帶Einv-Eagg基因1株。8株(7.3%)11種毒力基因檢測均陰性。②攜帶CNF1或CNF2菌株的37例患兒中22例合并呼吸衰竭，15例需予NCPAP呼吸支持，10例合并多臟器受損，3例肺出血。③8對菌株分別來自同一患兒不同時期或不同部位，其中7對菌株經PFGE分型分別屬于同一基因型。3對分別來源于同一患兒不同時期的痰液標本菌株，PFGE分型一致，但毒力基因攜帶模式不相同。結論 本研究檢測到4種大腸埃希菌毒力基因，以Einv基因攜帶率最高；共發(fā)現(xiàn)7種毒力基因攜帶模式，以單純攜帶Einv基因最多見。CNF1及CNF2基因可能與肺部感染的嚴重性相關。

大腸埃希菌； 新生兒； 毒力基因

大腸埃希菌(Escherichiacoli)為機會致病菌，可以通過其他致病菌和基因重組發(fā)生水平轉移，特別是獲得毒力基因的大腸埃希菌菌株能在人和動物間引起大范圍的腸道內或腸道外感染[1]。大腸埃希菌是引起新生兒感染的重要病原菌之一，由于新生兒體液及細胞免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟、吞噬及補體功能缺乏致其易被感染[2]。大腸埃希菌腸道內感染主要可引起腹瀉，腸道外感染可引起泌尿系統(tǒng)感染、肺炎、敗血癥和化膿性腦膜炎等[3,4]。大腸埃希菌感染之所以成為臨床預防和控制的棘手問題，除因為其具有特殊的耐藥性之外，還因其產生眾多的毒力因子。近年來發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌不同血清型菌株的毒力和耐藥性之間有差別，毒力因子和耐藥性之間的關系受到關注[5]。不同的致病性大腸埃希菌所具有的毒力基因及其強弱不同，所致疾病也不同，因此毒力基因的檢測可指導臨床診斷、治療和判斷預后。目前，針對新生兒大腸埃希菌毒力基因的研究很少。本研究對首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院(我院)住院新生兒大腸埃希菌臨床分離株進行毒力因子檢測以了解其攜帶情況。

1 方法

1.1 菌株來源 收集2009年9月至2012年5月我院新生兒中心臨床診斷為新生兒肺炎、敗血癥[6]的連續(xù)病例，選擇其中抗生素使用之前痰液、血液、腦脊液或臍分泌物培養(yǎng)為大腸埃希菌的所有病例。菌株培養(yǎng)由我院檢驗中心細菌室培養(yǎng)鑒定。標準菌株：大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2 相關概念定義 ①根據(jù)發(fā)病日齡不同，將菌株分為早發(fā)型(≤7 d發(fā)病)及晚發(fā)型(>7 d發(fā)病)[7]。②根據(jù)標本來源不同，將菌株分為侵襲性感染(分離自血液及腦脊液的菌株)和非侵襲性感染(分離自痰液及臍分泌物的菌株)。③多重耐藥菌株是指一種微生物對≥3類抗生素同時耐藥，而非同一類中3種抗生素。

1.3 毒力基因檢測

1.3.1 主要試劑 硅膠模型TM基因組DNA提取試劑盒；PCR引物，溶菌酶，蛋白酶K；DNA Marker E；DNA loading buffer；2×Taq PCR Master Mix；含5%羊血的哥倫比亞血瓊脂平板。

1.3.2 DNA提取 菌株復蘇、培養(yǎng)，挑選純培養(yǎng)菌落置入0.5 mL離心管內(內預置200 ng·mL-1蛋白酶K溶液400 μL)，56℃水浴2 h，改95℃水浴10 min，即為基因檢測的模板液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴增

1.3.3.1 毒力基因檢測 參考文獻[8]選取11種最常見的毒力基因：不耐熱腸毒素(LT1)、耐熱腸毒素(ST1、ST2)、志賀樣毒素(VT1、VT2、VT2e)、細胞壞死因子(CNF1、CNF2)、A/E損傷因子(eaeA)、腸聚集因子(Eagg)和腸侵襲因子(Einv)。應用PCR方法對大腸埃希菌菌株進行毒力基因檢測，靶基因引物識別序列和目的產物長度[9]見表1。

1.3.3.2 反應體系 25 μL PCR體系：雙蒸水9.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×Mixture 12.5 μL，DNA模板1 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，63℃～64℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.3.3.3 電泳及成像 在1.5%瓊脂糖凝膠中加入0.5%核酸染料；取7 μL擴增產物與2 μL 6×Loading Buffer混合，6 μL Marker作為參照，并設陰性對照與PCR擴增產物在同一凝膠板進行同步電泳。電泳條件為：電壓120 V，電泳30 min。FR-200紫外與可見分析裝置儀分析并儲存于計算機。

1.3.4 基因測序和序列比對 對PCR陽性產物采用PCR直接全自動熒光法測序，測序儀器為美國ABI公司3730型毛細管全自動測序儀，測序由北京天一輝遠生物技術有限公司完成。采用Chromas軟件進行讀序，測序結果采用Chromas軟件直接進行BLAST Search比對。

1.4 脈沖場凝脈電泳(PFGE) 使用XbaⅠ限制性內切酶對大腸埃希菌菌株的DNA進行酶切，脈沖場凝膠電泳后采集的圖像應用Tenover等[10]提出的肉眼比對分型方法進行分型，按字母順序命名，并應用BioNumeries version(版本6.6)軟件進行圖像數(shù)字化處理及聚類分析，采用系統(tǒng)樹狀圖方法，用UPGMA(非加權配對算數(shù)平均法)描述，相似系數(shù)采用基于條帶比較的Dice系數(shù)，根據(jù)電泳產生條帶的位置和數(shù)量的不同,將同源性>80%作為分型標準，條帶位置誤差控制在1%，最優(yōu)化值設置為0.5%，共分65個型別。

表1 大腸埃希菌11種毒力基因的擴增引物[9]及產物長度

Tab 1 PCR primers of 11 virulence genes ofE.coliand size of products

GenePrimersProductsize/bpVT1fp：5′?ACGTTACAGCGTGTTGCRGGGATC?3′121bp：5′?TTGCCACAGACTGCGTCAGTRAGG?3′VT2fp：5′?TGTGGCTGGGTTCGTTAATACGGC?3′102bp：5，?TCCGTTGTCATGGAAACCGTTGTC?3′VT2efp：5′?CCAGAATGTCAGATAACTGGCGAC?3′322bp：5′?GCTGAGCACTTTGTAACAATGGCTG?3′eaeAfp：5′?TGAGCGGCTGGCATGAGTCATAC?3′241bp：5′?TCGATCCCCATCGTCACCAGAGG?3′CNF1fp：5′?GGCGACAAATGCAGTATTGCTTGG?3′552bp：5′?GACGTTGGTTGCGGTAATTTTGGG?3′CNF2fp：5′?GTGAGGCTCAACGAGATTATGCACTG?3′839bp：5′?CCACGCTTCTTCTTCAGTTGTTCCTC?3′LT1fp：5′?TGGATTCATCATGCACCACAAGG?3′360bp：5′?CCATTTCTCTTTTGCCTGCCATC?3′ST1fp：5′?TTTCCCCTCTTTTAGTCAGTCAACTG?3′160bp：5′?GGCAGGATTACAACAAAGTTCACAG?3′ST2fp：5′?CCCCCTCTCTTTTGCACTTCTTTCC?3′423bp：5′?TGCTCCAGCAGTACCATCTCTAACCC?3′Einvfp：5′?TGGAAAAACTCAGTGCCTCTGCGG?3′140bp：5′?TTCTGATGCCTGATGGACCAGGAG?3′Ea?ggfp：5′?AGACTCTGGCGAAAGACTGTATC?3′194bp：5′?ATGGCTGTCTGTAATAGATGAGAAC?3′

1.5 臨床資料截取 根據(jù)住院號查閱病史，截取以下資料用于本文分析：①性別、胎齡；②發(fā)病時間、臨床診斷、標本來源和標本采集時間；③培養(yǎng)報告中抗生素耐藥情況；④轉歸：好轉(癥狀有所緩解，炎性指標有所下降但未恢復至正常參考值)、痊愈(癥狀消失，輔助檢查恢復正常)。

2 結果

2.1 一般情況 2009年9月至2012年5月符合本文菌株來源共102例住院新生兒納入分析，共分離出110株大腸埃希菌菌株，其中8對菌株來自同一患兒的不同標本或同一患兒不同時期的同種標本。源于痰液79株(71.8%)，血液18株(16.4%)，腦脊液6株(5.4%)，臍分泌物7株(6.4%)。源于足月兒102株，早產兒8株。男64株，女46株。早發(fā)型27株，晚發(fā)型83株。侵襲性感染24株(早發(fā)型2株，晚發(fā)型22株)，非侵襲性感染86株 (早發(fā)型25株，晚發(fā)型61株)。新生兒肺炎67例；新生兒敗血癥35例(早發(fā)型5例，晚發(fā)型30例)，其中敗血癥合并化膿性腦膜炎17例(含化膿性腦膜炎合并硬膜下積液2例，化膿性腦膜炎合并腦室管膜炎1例 )，敗血癥合并泌尿系感染6例?；純航浛股卣?guī)治療后均好轉或痊愈出院。

2.2 毒力基因檢測結果 110株大腸埃希菌菌株中，Einv基因陽性101株(91.8%) ，其中源于痰液71株、血液18株、臍部分泌物6株和腦脊液6株；CNF1基因陽性24株(21.8%)，其中來源于痰液18株、血液6株；CNF2基因陽性14株(12.7%)，其中源于痰液12株、血液1株、臍部分泌物1株；Eagg基因陽性1株(0.9%)源于痰液；未檢測到ST1、ST2、VT1、VT2、VT2e、LT1和eaeA基因。

110株大腸埃希菌菌株毒力基因攜帶模式共有7種，單純攜帶Einv基因66株，單獨攜帶CNF1基因1株，同時攜帶Einv-CNF1基因20株，攜帶Einv-CNF2基因11株，攜帶Einv-CNF1-CNF2基因3株，攜帶Einv-Eagg基因1株，8株11種毒力基因檢測均陰性。3例攜帶Einv-CNF1-CNF2基因患兒中2例合并化膿性腦膜炎，其中1例合并腦室管膜炎。

2.3 大腸埃希菌分離株毒力基因在不同臨床診斷、發(fā)病日齡和標本來源間的差異 表2所示，毒力基因攜帶情況在不同臨床診斷、發(fā)病日齡和標本來源患兒間差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。攜帶CNF1或CNF2菌株的37例患兒中22例合并呼吸衰竭，15例需予NCPAP呼吸支持，10例合并多臟器受損，3例肺出血。

2.4 毒力基因與耐藥之間的關系 110株大腸埃希菌分離株中，對阿莫西林耐藥率最高(99株，90.0%)，其次為頭孢呋辛及頭孢曲松。多重耐藥大腸埃希菌56株(50.9%)。多重耐藥大腸埃希菌較非多重耐藥大腸埃希菌毒力基因攜帶率高(表3)。

2.5 毒力基因攜帶情況及PFGE分型與臨床的關系 8對菌株分別來自同一患兒的不同時期或不同部位的大腸埃希菌分離菌株(表4)。其中菌株編號3與6號，12與13號 ，20與21號，49與50號，62與65號，66與67號，69與70號，經PFGE分型分別屬于同一基因型。3與6號，12與13號，20與21號這3對分別來源于同一患兒不同時期的痰液標本菌株，PFGE分型一致，但毒力基因攜帶模式并不相同，查閱病史，這3例患兒病情均有進展，3、12及20號標本均于患兒入院當日留取標本，經檢測均只攜帶Einv基因，入院后經治療好轉均不明顯，患兒發(fā)熱、肺部癥狀加重，出現(xiàn)呼吸衰竭，需予呼吸機呼吸支持治療，故再次留取痰液標本，即為6、13及21號標本。檢測發(fā)現(xiàn)，6、13及21號標本除攜帶Einv基因外，6號菌株還同時攜帶CNF1及CNF2毒力基因，13號同時攜帶CNF1基因，而21號同時攜帶CNF2基因。而71與73號菌株雖然毒力基因攜帶情況一致，但經PFGE分型證實2株菌遺傳關系上距離較遠，屬于不同克隆群，故考慮為不同菌株感染或為污染。

表2 不同毒力基因在不同臨床診斷、發(fā)病日齡和標本來源患兒間的比較[strains(%)]

Tab 2 Comparisons of virulence gene between different diagnosis, onset age and sources in virulence gene carrying cases[strains(%)]

DiagnosisPneumonia(n=73)Septicemia(n=37)POnsetageEarly(n=27)Late(n=83)PSourcesNon?invasive(n=86)Invasive(n=24)PEinv65(89．0)36(97．3)0．26125(92．6)75(90．4)1．077(89．5)24(100)0．218CNF115(20．5)9(24．3)0．655(18．5)20(24．1)0．54818(20．9)5(20．8)0．992CNF211(15．1)3(8．1)0．4646(22．2)8(9．6)0．1713(15．1)1(4．2)0．282Eagg1(1．4)0(0)1．00(0)1(1．2)1．01(1．2)0(0)1．0Negative7(9．6)1(2．7)0．3550(0)6(7．2)0．3438(9．3)0(0)0．268

表3 多重耐藥與非多重耐藥大腸埃希菌毒力基因攜帶情況比較[strains(%)]

Tab 3 Comparisons of virulence gene detection rate between cases with or without multiple drug resistance toE.coli[strains(%)]

ToxingeneMultipledrugresistance(56strains)Non?multipledrugresistance(54strains)PEinv37(66．1)29(53．7)0．186Einv?CNF15(8．9)15(27．8)0．01Einv?CNF28(14．3)3(5．6)0．127Einv?CNF1?CNF23(5．4)0(0)0．255CNF10(0)1(1．9)0．491Eagg?Einv1(1．8)0(0)1．0Negative2(3．6)6(11．1)0．248

表4 8對來自同一患兒的不同時期或不同部位的大腸埃希菌分離菌株毒力基因PFGE分型

Tab 4 PFGE typing of 8 pairs of clinical isolates from same neonatal patient isolated from different time or different sites

No．SitesToxingenePFGEDiagnosis3SputumEinvP48Pneumonia，septicemia6SputumEinv?CNF1?CNF2P48Pneumonia，septicemia，respiratoryfailure12SputumEinvP1Pneumonia13SputumEinv?CNF1P1Pneumonia，respiratoryfailure20SputumEinvP48Pneumonia21SputumEinv?CNF2P48Pneumonia，respiratoryfailure49SputumNegativeP8Pneumonia50SputumNegativeP8Pneumonia62SputumEinv?CNF1P13Pneumonia65SputumEinv?CNF1P13Pneumonia66CSFEinvP45Septicemia，meningitis67BloodEinvP45Septicemia，meningitis69CSFEinvP45Septicemia，meningitis70CSFEinvP45Septicemia，meningitis71SputumEinvP61Pneumonia73SputumEinvP3Pneumonia

Notes CSF: cerebrospinal fluid

3 討論

本研究住院新生兒大腸埃希菌分離株來源以痰液為主，其次為血液，腦脊液來源較少。臨床診斷為肺炎及敗血癥，其中部分敗血癥合并化膿性腦膜炎，而敗血癥合并泌尿系統(tǒng)感染少見 ，這與成人有所差別[11](成人大腸埃希菌感染中泌尿系統(tǒng)感染較多見)[12～14]。本研究中早發(fā)型感染27株，晚發(fā)型感染83株，17例化膿性腦膜炎患兒均為晚發(fā)型。提示我院住院新生兒大腸埃希菌感染以晚發(fā)型為主，晚發(fā)型患兒臨床癥狀更重，侵襲性感染多見。本研究Einv基因攜帶率最高，其次為CNF1基因及CNF2基因。共發(fā)現(xiàn)7種毒力基因攜帶模式，以單純攜帶Einv基因最多見。

Einv為腸侵襲性毒力基因，能導致腸黏膜細胞發(fā)生變性、壞死，引起組織慢性、出血性和壞死性炎癥[15～18]。既往研究報道[8,15]Einv與腸內感染有關，而本研究110株來自于腸道外的大腸埃希菌分離株中有101株均檢測到Einv，其中24株侵襲性感染菌株均攜帶Einv基因，而這些患兒均不存在腸道內感染表現(xiàn) 。提示Einv基因在腸道外感染，尤其侵襲性感染中可能也起到一定作用，這與陶云珍等[8]研究結果一致。

CNF因子可致組織損傷和動物宿主死亡，約50%致腸外感染的大腸埃希菌和20%致腹瀉的大腸埃希菌產生該因子[19]。CNF1是一種皮膚壞死毒素，能通過激活Rho GTP酶超家族的RhoARac1cdc42蛋白來增加細菌的侵襲力, 并能調節(jié)多形核白細胞的功能[20]。結合臨床表現(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，本研究攜帶CNF1或CNF2的菌株患兒肺部病變更重，其中22例合并呼吸衰竭，15例需NCPAP呼吸支持，10例合并多臟器受損，3例肺出血。提示CNF1及CNF2毒力基因可能與肺部損害嚴重程度密切相關 ，這與陶云珍等[8]研究結果一致。

本研究中有 8對來源于同一患兒不同部分或同一患兒不同時期分離菌株。其中4對PFGE分型及毒力基因攜帶情況完全一致，尤其66號分離自腦脊液，67號分離自同一患兒的血液，屬于同一基因型，而且兩標本均只攜帶Einv毒力基因，提示新生兒化膿性腦膜炎可以源于血源性。3對分別來源于同一患兒不同時期的痰標本，PFGE分型一致，但毒力基因攜帶模式不同，這3例患兒入院當日標本均只檢測到Einv基因，病情加重后留取的標本除攜帶Einv基因外，還分別檢測到CNF1和(或)CNF2毒力基因，可見通過PFGE分型及毒力基因檢測可幫助區(qū)分臨床致病菌，同時也提示CNF1及CNF2毒力基因可能與肺部損害嚴重程度密切相關。

迄今為止，有關耐藥基因和毒力基因間的相關性研究較少見。近年研究[21,22]表明，質粒、轉座子、整合子基因盒及噬菌體等可塑性的遺傳因子使細菌基因具有可變性，也是造成耐藥性廣泛傳播的重要原因，揭示了獲得外源性毒力基因的可能性。如果毒力基因和耐藥基因位于相同的可移動元件上，在抗生素的作用下 ，會引起共轉移，造成毒力和耐藥性同時增強[23]。本研究中多重耐藥大腸埃希菌56株，毒力基因攜帶模式多樣化；非多重耐藥大腸埃希菌54株，毒力基因攜帶模式較簡單，不含本研究所檢測的11種毒力基因菌株比例較高。3株多重耐藥菌株，攜帶3種毒力基因，患兒臨床表現(xiàn)更嚴重，均存在敗血癥，2例合并化膿性腦膜炎，其中1例合并腦室管膜炎，治療時間長。提示大腸埃希菌毒力基因攜帶情況與疾病嚴重程度相關；大腸埃希菌毒力基因與細菌耐藥間可能存在相關性。

[1]Ron EZ. Distribution and evolution of virulence factors in septicemic Escherichia coli. Int J Med Microbiol, 2010, 300(6):367-370

[2]Moissenet D, Salauze B, Clermont O, et al. Meningitis caused by Escherichia coli producing TEM-52 extended-spectrum beta-lactamase within an extensive outbreak in a neonatal ward: epidemiological investigation and characterization of the strain. J Clin Microbiol, 2010, 48(7):2459-2463

[3]Orskov I, Orskov F. Escherichia coli in extra-intestinal infections. J Hyg (Lond), 1985, 95(3):551-575

[4]Liu XW(劉曉巍), Fan L, Zhang WY, et al.新生兒宮內感染43例的相關因素分析. Chin J Clinicians(Electronic Edition)[中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)], 2011,5(10):3027-3030

[5]An W(安微), Zhang XY, Li R, et al. 致病性大腸桿菌毒力因子和耐藥性研究進展. 畜牧與獸醫(yī)(Animal Husbandry & Veterinary Medicine), 2013, 45(8):106-109

[6]邵肖梅，葉鴻瑁，丘小汕. 實用新生兒學. 第4版. 人民衛(wèi)生出版社，2011

[7]Jiang Y(姜毅). 新生兒敗血癥診療進展.Chinese Journal of Neonatology(中國新生兒科雜志)，2010,25(2)：69

[8]Tao YZ(陶云珍), Ding YF, Mi ZH. Detection of virulence genes of Escherichia coli from newborn infants. Chin J Pediatr(中華兒科雜志)，2004,42(12)：954

[9]Pass MA, Odedra R, Batt RM. Multiplex PCRs for identification of Escherichia coli virulence genes. J Clin Microbiol, 2000, 38(5):2001-2004

[10]Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis：criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 1995, 33(9):22233-22239

[11]Wang YP(汪一萍), Chen GZ, Lu Y, et al. Virulence genes in multidrug resistant Escherichia coil. Chin J Clin Infect Dis(中華臨床感染病雜志)，2012,5,(1)：19-20

[12]Zhai RB(翟如波), Qiu GB, Zhang H, et al. The characteristics of nosocomial infection and antimicrobial resistance changes of 1287 strains of Escherichia coli. Chin J Exp Clin Infect Dis (electronic Edition)[中華實驗和臨床感染病雜志(電子版)]，2013，7，(1)：63-66

[13]Hu ZJ(胡志軍), Pan XL, Zhou DS, et al. Clinical distribution and surveillance of bacterial resistance of 1 526 strains of escherichia coli. Anhui Medical and Pharmaceutical Journal(安徽醫(yī)藥)，2014,18(2)：257-258

[14]Li YJ(李耀軍), Deng GJ. Current status of escherichia coli infections and drug resistance.Chinese Journal of Nosocomiology(中華醫(yī)院感染學雜志)，2012，22(14)：3156-3157

[15]Ahmed W, Tucker J, Bettelheim KA, et al. Detection of virulence genes in Escherichia coli of an existing metabolic fingerprint database to predict the sources of pathogenic E. coli in surface waters．Water Res, 2007 , 41(16):3785-3791

[16]Paton AW, Paton JC. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfbO157. J Clin Microbiol,1998,36(12):598-602

[17]Sasaki M, Sitaramans V, Babbinb A, et al. Invasive Escherichia coli are a feature of Crohn′s disease. Lab Invese, 2007, 87(3):1042-1054

[18]Bando SY, Moreno AC, Albuquerque JA, et al. Expression of bacterial virulence factors and cytokines during in vitro macrophage infection by enteroinvasive Escherichia coli and Shigella flexneri: a comparative study. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2010, 105(6):786-791

[19]Schmidt G, Sehr P, Wilm M, et al. Gln 63 of Rho is deamidated by Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor-1. Nature, 1997, 387(6634):725-729

[20]Davis JM, Rasmussen SB, O′Brien AD. Cytotoxic necrotizing factor type 1 production by uropathogenic Escherichia coli modulates polymorphonuclear leukocyte function．Infect Immun, 2005, 73(9):5301-5310

[21]張洪勛, 趙立平, 譯. 微生物功能基因組學．北京：化學工業(yè)出版社，2007. 52-83

[22]Bennett PM. Plasmid encoded antibiotic resistance：acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria. Br J Pharmacol, 2008, 153(1):347-357

[23]Villa L, García-Fernández A, Fortini D，et al. Replicon sequence typing of IncF plasmids carrying virulence and resistance determinants. J Antimicrob Chemother, 2010, 65(12):2518-2529

(本文編輯：張萍)

Virulence gene detection of Escherichia coli strains isolated from hospitalized neonates

SHENYan-hua1,WANGYa-juan1,YAOKai-hu2,GAOWei2,DINGYi-jun1,WUDan1,DONGFang3(DepartmentofNeonatalcenter,BeijingChildren′sHospitalaffiliatedtoCapitalUniversityofMedicalScience,Beijing100045,China)

WANG Ya-juan，E-mail:cxswyj@vip.sina.com

ObjectiveTo detect some virulence genes of theEscherichiacoli(E.coli) isolated from hospitalized neonates.MethodsSubjects were recruited based on consecutive cases who were diagnosed as pneumonia and septicemia from neonates hospitalized in the Neonatal Center of Beijing Children′s Hospital from September 2009 to May 2012. Before using antibiotics sputum, blood, cerebrospinal fluid, or navel secretion cultivation were selected for cases ofE.coli. According to the onset age, strains were divided into early-onset or late onset. According to different sources of specimens, strains were divided into invasive infection and non invasive infection. Polymerase chain reaction (PCR) method was used to detect the 11 most common virulence genes ofEscherichiacoli, including heat-labile (LT1) ,heat-stable (ST1 andST2) toxins, verotoxin types1, 2, 2e (VT1,VT2 andVT2e, respectively), cytotoxic necrotizing factors (CNF1 andCNF2), attaching and effacing mechanisms (eaeA), enteroaggregative mechanisms (Eagg),and enteroinvasive mechanisms (Einv). Chromas software was used to read sequence, the sequencing results directly performed for BLAST searching by using Chromas software.ResultsA total of 110Escherichiacolistrains were isolated from extraintestinal sites in 102 neonates. From respiratory secretions (sputum) 79 strains (71.8%) were isolated, and blood 18 strains (16.4%), cerebrospinal fluid 6 strains (5.4%), umbilical discharge 7 strains (6.4%). Among the involved neonates, 102 were from full-term infants, 8 strains from preterm neonates. There were 27 early-onset strains, 83 late onset strains. 24 strains of invasive infection, 86 strains of non invasive infection. Sixty-seven cases were diagnosed as pneumonia and 35 cases as neonatal septicemia. ① One hundred and one strains (91.8%) were positive forEinvgene, 24 strains (21.8%) were positive forCNF1 gene, 14 strains (12.7%) were positive forCNF2 gene, 1 strain (0.9%) was positive forEagggene. ②Among 110 strains, there were 7 different toxin gene profiles. Only carryingEinvgene was the most common, harbored by 66 isolates (60%).One strain (0.9%) carriedCNF1 gene, 20 strains (18.2%) carriedEinvandCNF1 genes, 11 strains (10.0%) carriedEinvandCNF2 genes, 3 strains (2.7%) carriedEinv,CNF1 andCNF2 genes, only 1 strain (0.9%) carriedEinvandEagggene, 8 strains of them had none of the 11 virulences(7.3%). ③The virulence gene carrying rate and different toxin gene profiles ofE.colistrains did not significantly differ in sites or disease onset age. There were 37 cases carringCNF1 orCNF2 gene, of them, 22 cases with respiratory failure, 15 cases needed NCPAP respiratory support, 10 cases with multiple organ damage, 3 cases with pulmonary hemorrhage. ④There were 8 pairs of clinical isolates from same neonatal patient, but they were isolated from different time or different sites. Seven pairs of clinical isolates belonged to the same genotype after PFGE typing, and 3 pairs of strain were isolated from different times of the same neonate, PFGE typing result was consistent, but the virulence gene carrying mode was not the same.ConclusionThis study showed that PCR method could be used to detect 11 virulence genes, but only 4 genes were detected. The most abundant toxin gene wasEinv. There were 7 different toxin gene profiles. Only carryingEinvgene was the most common.CNF1 andCNF2 gene may be related with severity of pneumonia.

Escherichiacoli; Neonatal; Virulence gene

首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院 1 新生兒中心;2 微生物免疫室;3 檢驗科細菌室 北京，100045

王亞娟，E-mail:cxswyj@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.01.011

2014-10-03

2015-01-17)