劉 杰，楊國強，李 成，于 力，盧振蘭，孫國志

1．吉林省環(huán)境監(jiān)測中心站，吉林 長春 130011

2．吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林 長春 130000

3．公主嶺市環(huán)境保護監(jiān)測站，吉林 公主嶺 136100

構(gòu)成廢水生物毒性的物質(zhì)具有多樣性和不確定性，對生命機體產(chǎn)生的毒害作用也存在多種方式，或?qū)е轮舷ⅲ蛴绊懮窠?jīng)系統(tǒng)以及循環(huán)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等。致毒機理的差異要求測定技術(shù)體系具有對等的適應(yīng)性，這樣的要求給測試技術(shù)提出難題;由于毒害作用現(xiàn)象具有差異，較低等的試驗生物可能由于沒有發(fā)育形成相應(yīng)的辨別毒性的組織系統(tǒng)，識別毒性的偏激性或更為突出(如無內(nèi)分泌功能的低等試驗生物對于內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性物質(zhì)的識別等)。魚類是水中機體進化發(fā)育更接近于人類的高等動物，使用魚類作為試驗動物的毒性測定方法獲得了更廣泛的應(yīng)用。在淡水范圍內(nèi)，魚類的種類繁雜多樣，受試魚種類的選擇、方法的試驗形式、試驗魚的種內(nèi)差異和來源差異以及如何使用方法內(nèi)在的線性推導(dǎo)，同樣給技術(shù)體系帶來不同的影響。這些宏觀上的影響與方法技術(shù)操作的細微影響一樣，也需要進行有效的質(zhì)量控制，才能獲得方法技術(shù)體系與待測目標樣本間的對應(yīng)統(tǒng)一，從而保證測量結(jié)果的正確性。

經(jīng)典的毒性測定技術(shù)主要考慮“已知毒性”如何有效應(yīng)用的篩分與度量，在保證一致性和重現(xiàn)性的基礎(chǔ)上，選定試驗動物(如小白鼠)，利用統(tǒng)一的靈敏性尺度滿足毒性效應(yīng)間橫向?qū)Ρ确治龅暮侠硇?。環(huán)境管理中這種技術(shù)應(yīng)用的重點是生態(tài)系統(tǒng)，毒性試驗的目的在于能以一定準確度去預(yù)報對整個系統(tǒng)無害的濃度，或稱“確定一種廢物的最高濃度”［1］作為允許濃度以保障水環(huán)境的安全。經(jīng)典方法的共同特點是該被測毒物一般為“已知”，且實驗并不急于即刻獲得結(jié)果。而應(yīng)用于廢水領(lǐng)域以識別毒性的存在和預(yù)警為目標的測試技術(shù)則與之不同，后者多屬于“未知毒性”的體系和以“毒性現(xiàn)狀”為直接測試目標。

隨著對危害人群健康因素的了解和環(huán)境污染控制范圍的擴大，捕獲未知毒性存在的預(yù)警意義越來越大。為滿足這種需求，靈敏性通用尺度的確認越來越重要，因為它關(guān)乎到方法的檢出限。另外，出于監(jiān)管和預(yù)警的需求，其實驗結(jié)果也應(yīng)及時產(chǎn)出，這是兩者質(zhì)的差異。此外，監(jiān)管的主要目標是“現(xiàn)狀”，而生態(tài)影響限度的確認需求則可能是被“稀釋后的濃度”。基于監(jiān)管的需求，方法對毒性的檢出能力成為廢水毒性管理預(yù)警測定宏觀質(zhì)控的第一要素，更靈敏的試驗魚種類的選擇成為方法適用性的前提。

魚類是水中最高等級的動物，常見的毒性測定技術(shù)多采用魚類作為試驗生物，其原因在于魚類能夠照顧到來自更多方面的毒性刺激，捕獲面更廣。但是，單一的魚類在測定時同樣具有偏執(zhí)性，是否采用組合魚的結(jié)構(gòu)形式成為方法宏觀質(zhì)量控制的又一因素。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，是否可以及時獲得所需的“試驗動物”，即試驗動物的來源成為廢水毒性測試應(yīng)用至關(guān)重要的限制因子，因此，同一種類不同來源的試驗魚對方法有怎樣的影響也需要通過宏觀質(zhì)量控制的研究予以確認。傳統(tǒng)方法依據(jù)預(yù)實驗段的“效應(yīng)-濃度曲線”推定未稀釋前的現(xiàn)狀毒性結(jié)果，由于預(yù)實驗段“最大無致死”與“最小全致死”濃度均為節(jié)點(24或96 h)效應(yīng)，而在某一節(jié)點恰當?shù)倪_到“無或全”實驗效應(yīng)的重現(xiàn)性很難控制，特別是96 h節(jié)點受試魚類的死亡數(shù)量變化已經(jīng)很?。?］，微弱的影響也會形成節(jié)點前后漂移，其結(jié)果的重現(xiàn)性波動可能影響預(yù)實驗段曲線的線性，加之毒性物質(zhì)持續(xù)稀釋過程中可能存在濃度與效應(yīng)等比率跟隨性變化，兩者疊加更顯現(xiàn)方法預(yù)實驗形式質(zhì)控認定的重要。為此，研究兩者間曲率匹配的可控性也成為方法學宏觀質(zhì)量控制的研究內(nèi)容。

綜上，研究針對樣品實驗對應(yīng)的4個問題設(shè)計了實驗?zāi)繕?①試驗魚種類的靈敏性選擇對方法檢出限的影響;②魚類毒性測定方法中是否采用魚類組合形式對方法的影響;③同種魚類不同來源對方法測定結(jié)果的影響;④多樣品強毒性至低毒性系列化同步稀釋條件下各稀釋度與毒性強度等比率變化的區(qū)間跟隨性波動查找。特別增加了重鉻酸鉀、氯化汞溶液、杜邦萬靈殺蟲劑等已知毒物樣品的實驗，這些樣品基本可以保證在整體實驗過程中不會引入可能的菌類以導(dǎo)致毒性被凈化降解的可能，也能夠保證多次實驗條件下樣品的一致性，使實驗結(jié)果更為可靠。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

泥鰍(成年，體重35～45 g);劍尾魚(成年，體長6．0～6．5 cm);黑鰭紅月光魚(5月齡左右，體長2．5～3．0 cm);斑馬魚(3 月齡左右幼魚，體長2．3～2．8 cm);青鳉(3 月齡左右幼魚，體長2．0～2．5 cm);紅鼻剪刀魚(3 月齡左右幼魚，體長2．5～3．0 cm);虎皮魚(3 月齡左右幼魚，體長2．0～2．5 cm);馬頭鰍(3 月齡左右幼魚，體長5．5 ～6．5 cm);紅綠燈魚(3 月齡左右幼魚，體長1．8 ～2．3 cm)等。

1.2 毒性樣品

氯化汞(3．2 mg/L及以下濃度)、重鉻酸鉀(825 mg/L及以下濃度)、杜邦萬靈殺蟲劑(6 g/L及以下濃度)、害光光殺蟲劑(1 g/L及以下濃度)、除草劑(50 mL/L及以下濃度)中間體化工廢水(樣品原液及以下各百分比濃度)等已知毒物;制藥類、化工類、印染、造紙、電子、電鍍等多行業(yè)未知毒性廢水。

1.3 實驗方法

對應(yīng)目標1的實驗方法:為滿足實驗一致性和重現(xiàn)性的要求，對多種魚多樣品進行同步對比實驗，以獲得識別毒性等級的差異性比較。

對應(yīng)目標2的實驗方法:符合檢出限要求且靈敏性接近的試驗魚對不同毒物也應(yīng)具有感知的選擇性，采用更換各種選定試驗魚分別對同一樣品進行實驗的方式，查找單一種類判定偏執(zhí)的可能性，采取魚類組合形式進行同樣的實驗，對2種情況下方法實驗的可信性水平進行分析并獲得結(jié)論。

對應(yīng)目標3的實驗方法:同一種類的試驗魚在國內(nèi)可以有不同的來源，有專業(yè)機構(gòu)定向培育、市場商品化培育等區(qū)別，市場化培育后還有體色的差異性等。采用不同來源但種屬、規(guī)格相同的魚進行多樣品毒性測定對比實驗，如產(chǎn)生顯著差異，則建議使用特定來源的試驗魚，反之，則獲得試驗魚的途徑限制將被打破，監(jiān)管急需條件下及時獲得試驗魚的障礙將破除。

對應(yīng)目標4的實驗方法:經(jīng)典的毒性試驗方法通常采取稀釋和預(yù)實驗的方式進行，預(yù)實驗采取該樣本稀釋后“最小全致死”和“最大無致死”區(qū)間的段落建立稀釋百分比率與致死率間的對應(yīng)關(guān)系曲線，由曲線經(jīng)計算獲得50%致死率對應(yīng)的稀釋百分比，并將該稀釋百分比率的倒數(shù)確定為毒性單位繼而獲得毒性評價結(jié)果。實驗要求被測毒性物質(zhì)由最低濃度(或毒性)到最高濃度(或毒性)的整個區(qū)間都能夠與預(yù)實驗段的曲率相同而不應(yīng)出現(xiàn)階段性轉(zhuǎn)折的現(xiàn)象。然而，受試動物在持續(xù)染毒過程中可能會對該毒性逐步產(chǎn)生抗體而又隨著染毒的加深而崩潰，毒物自身的致毒屬性在不同的濃度層級也會有“斷崖”現(xiàn)象，這樣的過程以及其他因素將導(dǎo)致線性延伸過程形成轉(zhuǎn)折性波動，影響數(shù)據(jù)結(jié)果質(zhì)量。實驗通過考察多種相同毒性毒物等比率稀釋過程中毒性強度線性是否存在陡然轉(zhuǎn)折的現(xiàn)象來證明這種離線存在的可能性。

1.4 實驗條件

實驗條件均依照或參考《水質(zhì) 物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》(GB/T 13267—1991)［3］、《工業(yè)廢水魚類急性毒性試驗》(GB/T 21814—2008)［4］等條款執(zhí)行;部分實驗結(jié)果依照半致死條件下試驗魚類持續(xù)染毒時數(shù)(耐毒時數(shù))的差異進行結(jié)果判定。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗魚種類的靈敏性選擇對方法檢出限構(gòu)成的影響

表1顯示了部分小型魚對部分制藥企業(yè)廢水的生物毒性測試結(jié)果。

表1 部分小型魚對部分制藥企業(yè)廢水的生物毒性測試結(jié)果

由表1可見，雖同為小型魚類，在廢水毒性試驗中，其靈敏性的差異仍表現(xiàn)明顯，黑鰭紅月光魚為紅色劍尾魚的父母代種類，與灰色劍尾魚的生物學特點相似，耐毒性強。該魚與紅鼻剪刀魚或與虎皮魚相比較，對同一樣品測定結(jié)果有明顯差異，最大時可達2個以上毒性等級，一般情況下也達1個毒性等級。研究在3 a多時間的數(shù)次實驗中進行了同樣目標的比較，樣品及試驗魚類采集區(qū)涵蓋了東北、江蘇、上海等地，這種由魚類種屬差異導(dǎo)致的對毒性感知靈敏性的差異極為普遍，經(jīng)實驗選擇，在各省市當?shù)厮迨袌鲆撰@的小型魚類中，紅鼻剪刀魚、虎皮魚、馬頭鰍、雪鯛、紅綠燈魚等為廢水毒性測定高靈敏性層級的試驗魚類;其次是中等靈敏度層級的斑馬魚、孔雀魚和青鳉;再次是靈敏性較遲鈍層級的劍尾魚、黑鰭紅月光魚等?；⑵~等靈敏性強的試驗魚類應(yīng)成為預(yù)警監(jiān)管方法試驗用魚的首選。

2.2 是否采用組合魚形式對方法測定結(jié)果的影響

1．4倍率稀釋條件下害光光殺蟲劑、杜邦萬靈殺蟲劑及重鉻酸鉀等各6組梯度斑馬魚與虎皮魚96 h內(nèi)半致死差異比較的實驗結(jié)果見表2。

表2 幾種等強度毒性物質(zhì)等比率稀釋后的強度改變離散實驗情況

由表2可見，多次實驗中斑馬魚對于害光光殺蟲劑的弒殺作用有明顯的抗性，而該魚在其他毒物中的表現(xiàn)則十分正常，這樣的現(xiàn)象也曾在某除草劑的毒性試驗中出現(xiàn)過，可見，單憑一種試驗魚的實驗結(jié)果就對毒物作出結(jié)論性評價會出現(xiàn)不公正現(xiàn)象。廢水毒性的監(jiān)管測定應(yīng)采用多種小型魚共同進行同一實驗的組合技術(shù)形式。

2.3 同種魚類不同來源對方法測定結(jié)果的影響

配置多種廢水的混合液進行了3種濃度條件下對應(yīng)致死率(百分率)的持續(xù)染毒時間實驗，結(jié)果見表3。

表3 不同來源的同種魚類在3種實驗液中對應(yīng)致死百分率的持續(xù)染毒時間表

由表3可見，在規(guī)格、健康程度基本相同條件下，同種魚類雖然來源不同，體色不同，仍沒有使實驗的總差異率超過10%(絕大多數(shù)不超過5%)，沒有構(gòu)成對廢水毒性測定結(jié)果的明顯影響。于洋等［5］在使用電鍍廢水進行的毒性試驗中，選擇了不同來源的斑馬魚、劍尾魚、紅鼻剪刀魚、虎皮魚、馬頭鰍、青鳉、紅綠燈魚等進行同樣的測試，也證明不同來源的同種屬試驗魚在規(guī)格、健康程度基本相近的條件下，不會對廢水毒性測定的結(jié)果產(chǎn)生不利影響。

2.4 稀釋度與毒性強度等比率變化的區(qū)間跟隨性波動查找

表4給出斑馬魚在5種差異性毒物同步稀釋液中持續(xù)染毒達半致死時間表。表5為氯化汞濃度為0．595 mg/L及以下濃度1．4倍率稀釋條件下的毒性強度半致死時間表。

由表4及表5可見，等比率稀釋條件下，其毒物毒性變化并不一定能夠與稀釋比率保持同步，且明顯存在著跟隨性波動，也很可能發(fā)生類似氯化汞濃度為0．595 mg/L前后毒性效應(yīng)驟然變化的現(xiàn)象，具有這樣階段性變化的毒性物質(zhì)很有可能導(dǎo)致經(jīng)典方法預(yù)實驗階段與其他段落的線性沖突。

表4 斑馬魚在5種差異性毒物同步稀釋液中持續(xù)染毒達半致死時間表

表5 氯化汞0.595 mg/L及以下濃度1.4倍率稀釋條件下的毒性強度半致死時間表

因此，在未知毒物的實驗中，在不能證明被測毒性物質(zhì)的整體稀釋過程濃度-效應(yīng)線性連續(xù)性穩(wěn)定變化的情況下，進行先行稀釋再行反推求得現(xiàn)狀毒性強度的實驗形式存在嚴重的宏觀質(zhì)量控制漏洞。由于廢水毒性預(yù)警監(jiān)管測試的主要目標是獲得現(xiàn)狀條件下廢水的毒性，而非稀釋某倍數(shù)的毒性，因此，直接測定現(xiàn)狀，直接表述樣品原液的毒性等級才是廢水毒性測試所需要的方法形式。

3 結(jié)論與建議

3.1 結(jié)論

廢水中未知、混合毒物毒性現(xiàn)狀狀態(tài)的常規(guī)化預(yù)警監(jiān)管測定與傳統(tǒng)的已知毒物毒性的生態(tài)保護影響測定不僅存在著測試目的性差異，更存在應(yīng)用時效性要求的差異。服務(wù)于生態(tài)保護的傳統(tǒng)方法移植到廢水預(yù)警監(jiān)管領(lǐng)域存在著宏觀質(zhì)量控制等多方面問題。首先，能夠滿足GB/T 13267—1991和GB/T 21814—2008國家標準要求的試驗魚在廢水未知毒性現(xiàn)狀狀態(tài)的分析中靈敏性不足，導(dǎo)致了方法的檢出限至少相差1個等級;第二，上述國標為單一魚的急性毒性試驗標準，使用單一的魚類對廢水做出評價結(jié)論，其可信性水平較組合形式的試驗方法低;第三，不同來源的試驗魚類在健康、體重等表面條件基本一致的前提下，不會對廢水的急性毒性試驗結(jié)果產(chǎn)生不利影響，使用當?shù)厮迨袌龅挠^賞魚(如斑馬魚)可以起到近交系斑馬魚相同的效果，哪怕體色的不同亦不會影響結(jié)果的正確性;第四，傳統(tǒng)方法預(yù)實驗獲得96 h節(jié)點“最小全致死濃度”波動帶給實驗的繁瑣性和不確定的時間消耗，更存在線性質(zhì)量控制難于操作的問題，預(yù)實驗段曲線可能存在的誤差很容易導(dǎo)致反推整體線性結(jié)果的缺陷。在以現(xiàn)狀毒性水平為實驗結(jié)果需求的水污染毒性監(jiān)管當中，依據(jù)有稀釋過程和預(yù)實驗的技術(shù)可能會導(dǎo)致實驗結(jié)果的偏離，從而影響管理判定的正確性。綜上，建議以現(xiàn)狀表述為主要目標的廢水未知毒性測定盡可能回避稀釋的實驗過程。

3.2 建議

相關(guān)研究已建立了水污染源生物毒性監(jiān)測技術(shù)體系，提出了廢水毒性測試的“時間-劑量效應(yīng)”方法技術(shù)［6］，可以成為常規(guī)化廢水毒性預(yù)警監(jiān)管的實用方法技術(shù)。廢水毒性的存在極為普遍［7］，廢水毒性監(jiān)測的常規(guī)化運行多年以來未能實現(xiàn)，研究破解了關(guān)鍵的制約因子，給方法運行以可行之路，方法的普及直接關(guān)系到環(huán)境監(jiān)管從已知污染跨越到未知污染的深度。中共中央“關(guān)于全面深化改革若干重大問題的決定”(以下簡稱“決定”)提出了改革生態(tài)環(huán)境保護管理體制的要求。其中“建立和完善嚴格監(jiān)管所有污染物排放的環(huán)境保護管理制度”是“決定”的核心內(nèi)容也是防治污染、保障人群健康的一般要求，而只有通過生物毒性預(yù)警監(jiān)測項目的常規(guī)化普及，大范圍發(fā)現(xiàn)毒性并配合大型儀器的進一步確認分析，才能由毒性索跡追蹤逐步實現(xiàn)“決定”的目標，才能促進廢水污染預(yù)警監(jiān)測體系建設(shè)的發(fā)展，有的放矢為環(huán)境監(jiān)管提供更好的支持。

［1］Cairns J．水污染的生物監(jiān)測［M］．曹鳳中，譯．北京:中國環(huán)境科學出版社，1989:139．

［2］Sprague J B．Measurement of pollutant toxicity to fish-I．Bioassay methods for acute toxicity［J］．Water Res，1979(3):793．

［3］GB/T 13267—1991 水質(zhì) 物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法［S］．

［4］GB/T 21814—2008 工業(yè)廢水魚類急性毒性試驗［S］．

［5］于洋．八種魚對某電鍍廢水急性毒性的敏感性試驗［J］．北方環(huán)境，2013(8):155-157．

［6］Liu J，Liu A L，Yu B L．A novel approach to rapid detection ofacute watertoxicity and its policy implications for grassroots sustainable environmental monitoring［J］．Environmental Monitoring，2012，14:1 196．

［7］J?nsson K，Jansen J．Screening method for evaluation of inhibition of nitrification in Sweden［J］．Water Science and Technology，1999，40(2):175-178．