程樹強，王正蓉

(貴陽醫(yī)學院附院 臨檢科，貴州 貴陽 550004)

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種機會性專性細胞內(nèi)寄生原蟲，可以感染包括人在內(nèi)的所有哺乳動物、鳥類和爬行動物，從而導致嚴重的人獸共患?。?］。當孕婦感染弓形蟲時，弓形蟲可經(jīng)胎盤感染胎兒導致流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒畸形，同時還可導致存活的子代失明、精神發(fā)育遲緩等各種嚴重的遠期后遺癥［1］。為了研究弓形蟲感染所導致的不良妊娠和先天性弓形蟲病的發(fā)病機制，現(xiàn)已建立了各種動物模型，主要有大鼠、小鼠、羊和靈長類動物等。但不同種系的動物對弓形蟲的易感性、感染后的癥狀及轉(zhuǎn)歸各有不同，同種動物不同遺傳背景，所表現(xiàn)的病理特征及免疫狀態(tài)也不盡相同。同時弓形蟲蟲株多樣性，毒力不一，對同一動物不同生理階段的感染能力、所致的疾病特征也各有不同［2］。本研究旨在建立合適而穩(wěn)定的弓形蟲先天性感染動物模型，為系統(tǒng)全面的研究弓形蟲的生殖毒性及其致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 弓形蟲蟲株 弓形蟲Prugniaud(PRU)株由蚌埠醫(yī)學院孫新教授惠贈，在昆明小鼠體內(nèi)傳代保種。取已感染PRU 株的昆明鼠腦組織，放入無菌勻漿器內(nèi)，用1 mL 無菌生理鹽水進行研磨，制備成腦組織勻漿液。取10 μL 腦組織勻漿液壓片后，在光學顯微鏡下共計數(shù)6 張玻片包囊數(shù)量取平均值(必要時再進行稀釋)。即得到該勻漿液中每10 μL所含的包囊數(shù)，4 ℃保存腦勻漿液待感染動物。

1.1.2 實驗動物 SPF 級6 ～8 周齡ICR 小鼠86只，體質(zhì)量20 ～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2006—0009。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及感染 將ICR 雌鼠86 只、雄鼠43 只按2∶ 1 隨機合籠交配，每籠6 只或9 只。次晨開始查陰栓，查到陰栓者計為孕0 d，共獲孕鼠77 只。38 只為孕早期組(孕1 d)，分為對照組6只、感染1 ～3 組分別為11、10 和11 只;39 只為孕晚期組(孕15 d)，分為對照組9 只和感染1 ～3 組各10 只。孕早期及孕晚期感染1 ～3 組孕鼠，分別灌胃含弓形蟲PRU 株10、20 和40 個包囊的小鼠腦組織勻漿液，對照組灌胃等量生理鹽水，分籠飼養(yǎng)，孕鼠正常取食和飲水。

1.2.2 觀察指標 觀察孕鼠生存狀態(tài)、發(fā)病過程、不良妊娠結(jié)局及產(chǎn)仔數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，率(%)的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 孕早期感染弓形蟲對孕鼠及子代的影響

孕早期孕鼠在感染后第6 ～7 天開始發(fā)病，出現(xiàn)聳毛、倦怠、弓背、閉眼、食欲減退等癥狀(圖1)，并于第8 天開始出現(xiàn)死亡，3 個小組在整個妊娠期間分別死亡4 只、5 只及11 只，死亡率達36.36%、50%和100%。對以10 個包囊感染孕鼠的小組中死亡的4 只孕鼠進行解剖見:腹水增加，甚至出現(xiàn)血性腹水，腹水涂片見大量白細胞、吞噬細胞和弓形蟲假包囊;在整個妊娠過程中，從孕第9 天開始4 只孕鼠相繼出現(xiàn)陰道流血，孕第17 天見一只孕鼠早產(chǎn)出泡狀胚胎組織，剖開胎膜見仔鼠并未發(fā)育成熟(圖2)。孕早期存活的7 只孕鼠僅一只產(chǎn)仔8只，不良妊娠結(jié)局高達85.71%。而對照組6 只孕鼠，共分娩仔鼠58 只，和感染組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

2.2 孕晚期感染弓形蟲對孕鼠及子代的影響

孕晚期感染后孕鼠在妊娠期發(fā)病不明顯，在分娩時或分娩后表現(xiàn)煩躁不安，易咬食仔鼠。10 個包囊感染的10 只孕鼠，產(chǎn)仔鼠70 只，其中死胎4只;9 只對照組雌鼠產(chǎn)仔鼠85 只，未觀察到死胎，兩組產(chǎn)仔數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。以20、40 個包囊感染的孕鼠可正常分娩，但遠期子代存活率小于85%。

3 討論

弓形蟲PRU 株為基因型Ⅱ型蟲株，屬于弱毒株弓形蟲，是在歐洲導致人群弓形蟲病感染和先天性弓形蟲病主要的蟲株［3－4］。我國對弓形蟲研究的基礎(chǔ)工作中多是基于導致嚴重眼弓形蟲病(脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎)的基因型Ⅰ型的RH 毒力株，而對基因型Ⅱ型的PRU 株在我國人群先天性感染報道較少。本課題以基因型Ⅱ型蟲株來建立動物先天性傳播模型。

動物模型是研究弓形蟲的致病機理和防治方法的基礎(chǔ)，小鼠是研究弓形蟲感染最常用的實驗動物之一。目前學者們多建立ICR 小鼠的慢性感染模型來觀察PRU 株感染后包囊形成、病理改變、機體免疫狀態(tài)等，顯示該小鼠適用于研究弓形蟲PRU 株的感染［5］。而用ICR 小鼠建立先天性弓形蟲傳播的模型鮮見報道。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，用該蟲株感染ICR 小鼠后表現(xiàn)出了一個急性發(fā)病期和慢性期的過程，符合該蟲株感染的病原學特性［6］，因此選擇ICR 小鼠作為先天弓形蟲傳播的實驗動物。

圖1 正常孕鼠和孕早期感染弓形蟲孕鼠的臨床表現(xiàn)Fig.1 Clinical manifestation of normal mice and early-pregnancy infection mice

圖2 孕早期感染后不良妊娠結(jié)局表現(xiàn)Fig.2 Adverse pregnancy outcomes of early-pregnancy infection mice

弓形蟲PRU 株有速殖子和緩殖子兩種狀態(tài)，前者有較強侵襲性，后者可在宿主腦組織內(nèi)形成包囊，當宿主免疫系統(tǒng)受到抑制或功能低下時，又可出現(xiàn)弓形蟲病的復發(fā)。本研究用弓形蟲PRU 株對孕第1 天小鼠進行感染，發(fā)現(xiàn)孕鼠感染后第2 ～6天并不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但至孕程第7 天后逐漸出現(xiàn)一個癥狀較重的急性期，到孕第18 天后逐漸恢復正常，符合弓形蟲PRU 株的致病特點。

在建立動物模型的同時，由于同一動物不同生理階段的感染能力、所致的疾病特征各有不同。因此有必要摸索ICR 小鼠是否適合建立弓形蟲垂直傳播的模型，以及較佳的弓形蟲感染劑量，便于以后的進一步研究。在本實驗中當弓形蟲PRU 株感染劑量達20 包囊時，孕鼠死亡率高達50%;40 包囊感染時，孕鼠死亡率達到了100%，說明這兩種感染劑量導致孕鼠在哺乳期發(fā)病及死亡率加大，使子代存活率過低，不利于進一步觀察弓形蟲感染所致的生殖毒性。因此選用10 包囊的低感染量，采用灌胃方式，模擬自然環(huán)境下的經(jīng)口感染途徑，建立垂直傳播動物模型，期望為下一步的研究打下基礎(chǔ)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在急性期內(nèi)孕鼠除表現(xiàn)聳毛，倦怠、食欲不振、弓背及閉眼外，以10 包囊感染的孕早期組的孕鼠在孕程第9 天后出現(xiàn)了流產(chǎn)、早產(chǎn)現(xiàn)象，孕鼠的死亡率達36.36%，比吳升偉等［6］直接用PRU 株弓形蟲感染非孕鼠死亡率(15%)高，并且急性感染癥狀幾乎持續(xù)到妊娠末，導致不良妊娠結(jié)局發(fā)生率增高。孕晚期感染弓形蟲對雌鼠所產(chǎn)仔數(shù)量影響不大，與孕早期感染弓形蟲相比，對孕鼠和子代的影響不那么顯著。同時觀察到孕晚期感染組孕鼠在分娩過程及分娩以后，易咬食仔鼠，這可能是由于弓形蟲對機體的毒性作用，導致雌鼠易激惹或弓形蟲感染損傷了子代，致使雌鼠發(fā)生咬食仔鼠的現(xiàn)象，有待進一步研究。

綜上所述，通過對10 個、20 個、40 個弓形蟲PRU 株包囊感染孕早期和孕晚期ICR 小鼠研究，發(fā)現(xiàn)以10 個包囊的低數(shù)量感染妊娠期小鼠，可以建立弓形蟲生殖毒性妊娠期小鼠動物模型，有利于進一步的研究。

［1］Weiss LM，Kim K.The development and biology of bradyzoites of Toxoplasma gondii［J］.Front Biosci，2000(5):391－405.

［2］劉媛，谷俊朝.構(gòu)建弓形蟲病動物模型的方法和意義［J］.中國熱帶醫(yī)學，2011(8):1028－1030.

［3］Peyron F，Lobry JR，Musset K，et al.Serotyping of Toxoplasma gondii inchronically infected pregnant women:predominance of type II in Europe and types I and III in-Colombia(South America)［J］.Microbes Infect，2006(9－10):2333－2340.

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［6］吳升偉，包懷恩，葛爽，等.弓形蟲Prugniaud 株感染小鼠后腦組織病理學動態(tài)觀察［J］.中國人獸共患病學報，2011(9):796－800.