劉宛玲,龍俊敏,肖建輝,牛麗亞，*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,江西南昌 330045;2.江西生物科技職業(yè)學院動科系,江西南昌 330200)

麥胚黃酮粗提物體外抗氧化及抑制非酶糖基化活性的研究

劉宛玲1,龍俊敏2,肖建輝1,牛麗亞1，*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,江西南昌 330045;2.江西生物科技職業(yè)學院動科系,江西南昌 330200)

采用自由基清除體系(DPPH、羥基及超氧陰離子)、螯合金屬離子能力、還原能力及總抗氧化能力體系評價麥胚黃酮粗提物的體外抗氧化活性,并考察麥胚黃酮粗提物對體外非酶糖基化反應的抑制作用。結(jié)果表明,麥胚黃酮粗提物清除自由基的能力、還原能力、總抗氧化能力均隨濃度的增大而增強,且清除DPPH自由基、羥基自由基能力的IC50值分別為0.26、0.78 mg/mL。在濃度0.75～3.0 mg/mL之間,隨濃度增大,其金屬離子螯合能力逐漸增強至78.60%,繼續(xù)增大濃度至3.75 mg/mL時,螯合能力降低至70.31%,但強于VC。此外,麥胚黃酮粗提物對體外蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的形成有抑制作用,且隨濃度增大,抑制效果逐漸增強。1.0 mg/mL麥胚黃酮粗提物對AGEs生成的抑制率在第7 d可達到48%。綜上可見,具有強體外抗氧化能力的麥胚黃酮,能有效抑制AGEs的生成。

麥胚黃酮粗提物,抗氧化活性,非酶糖基化終末產(chǎn)物

蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是在非酶促條件下,蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類或核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖(葡萄糖、果糖、戊糖等)的醛基經(jīng)過縮合、重排、裂解、氧化修飾后產(chǎn)生的產(chǎn)物。由于AGEs具有結(jié)構(gòu)交聯(lián)性和不可逆性,導致其在體內(nèi)難以被降解,當AGEs在體內(nèi)積累到一定程度時,會引發(fā)糖尿病病發(fā)癥的發(fā)生,如腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變和動脈粥樣硬化等[1-2]。

近年來研究發(fā)現(xiàn),AGEs 致病的主要機制在于誘發(fā)細胞內(nèi)活性氧的生成增多。廣泛存在于多種蔬菜、水果和谷類食物中的黃酮類化合物,在具有強抗氧化性的同時,能有效抑制AGEs的形成。如Xiuyuan Zhuang[3]研究發(fā)現(xiàn)沙棘籽渣黃酮對總AGEs和戊糖素的形成都具有顯著的抑制作用。

麥胚是面粉工業(yè)的副產(chǎn)品,雖在小麥籽粒中所占比例僅為1.4%～3.9%,但蘊藏著豐富的營養(yǎng)成分。麥胚中色素的主要成分是黃酮類化合物,包括黃酮、異黃酮、黃烷醇及其甙等一大類化合物,基本結(jié)構(gòu)為5,7,4-三羥基-3,5-二甲氧基黃酮,具有抗腫瘤、防止動脈硬化等生理活性[4]。由于我國對于小麥胚芽資源利用起步較晚,對于麥胚黃酮的開發(fā)利用有待進行深入研究。那么麥胚黃酮的抗氧化性能如何？麥胚黃酮對AGEs的生成是否如其他已報道黃酮類化合物一樣,具有抑制作用,值得探索。

本文通過研究麥胚黃酮粗提物的抗氧化性及對AGEs的抑制作用,以期能為其作為多功能化的食品基料進行開發(fā)利用,提供有用的科學依據(jù),并為麥胚資源的充分利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥胚芽 購自鄭州金苑面業(yè)有限公司;DPPH、菲啰嗪 購自北京中生瑞泰科技有限公司;總抗氧化(T-AOC)試劑盒 購自南京建成科技有限公司;氨基胍鹽酸鹽、牛血清白蛋白 購自北京百靈威科技有限公司;抗壞血酸 購自國藥集團化學試劑有限公司;其余試劑均為分析純 購自天津市福晨化學試劑廠。

TDL-5-A低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-5205 上海亞榮生化儀器廠;Scientz-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;V-5600型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;970CRT熒光分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;數(shù)顯恒溫磁力攪拌循環(huán)水箱 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥胚黃酮粗提物的制備 參照杜敏華等[4]實驗方法稍作修改,將小麥胚芽按料液比1∶8加入50%乙醇,50 ℃浸提4 h,重復三次,收集上清液,45 ℃旋蒸至無醇味,冷凍干燥,得到粉末,置于冰箱保存?zhèn)溆?。麥胚黃酮粗提物得率為24%。

使用時,分別準確稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g麥胚黃酮粗提物粉末,用50%乙醇溶解并定容至100 mL,得初始濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的麥胚黃酮粗提物樣液。其中清除DPPH自由基實驗樣液初始濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL。

1.2.2 清除DPPH自由基能力測定 參照劉昊[5]實驗方法稍作修改,2.0 mL樣液加入2.0 mL 0.004% DPPH(50%乙醇溶液),混勻,室溫避光反應30 min。以50%乙醇調(diào)零,517 nm處測定吸光度值A(chǔ)1,平行測定三次,取平均值。以2.0 mL 50%乙醇替代DPPH反應測吸光度值A(chǔ)2,以2.0 mL 50%乙醇替代樣液反應測吸光度值A(chǔ)0。以終濃度分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL VC作陽性對照。

1.2.3 清除羥基自由基能力測定 參照劉昊[5]實驗方法稍作修改,將2.0 mL樣液、2.0 mL 0.75 mmol/L H2O2溶液、2.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2.0 mL 3 mmol/L水楊酸混合,其中水楊酸最后加入啟動整個反應,37 ℃水浴30 min后,4000 r/min離心5 min,50%乙醇調(diào)零,510 nm處測定吸光度值A(chǔ)1,平行測定3次,取平均值。以2.0 mL 50%乙醇替代水楊酸測吸光度值A(chǔ)2,以2.0 mL 50%乙醇替代樣液測吸光度值A(chǔ)0。以終濃度分別為0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg/mL VC作陽性對照。

1.2.4 清除超氧陰離子自由基能力測定 參照張福平等[6]實驗方法稍作修改,取50 mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中,加入2.0 mL蒸餾水,混勻后于37 ℃水浴加熱20 min后,加入2.0 mL樣液,再加入37 ℃已預熱的25 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL,混勻后于37 ℃水浴中反應6 min,立即滴加1 mL 10 mmol/L的鹽酸終止反應,50%乙醇調(diào)零,325 nm處測定吸光值A(chǔ)1,以0.5 mL 50%乙醇替代鄰苯三酚測吸光度值A(chǔ)2,以2.0 mL 50%乙醇替代樣液測吸光度值A(chǔ)0,平行測定3次,取平均值。以終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL VC作陽性對照。

超氧陰離子自由基清除率(%)

1.2.6 還原能力測定 參照Shumaila Jan等[8]實驗方法稍作修改,2.0 mL不同濃度樣液于試管中,加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液2.5 mL(pH6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL,混勻,50 ℃水浴中反應20 min,快速冷卻,再加入10%三氯乙酸(TCA)2.0 mL,混勻,4000 r/min離心10 min,移取上清液2.5 mL于試管中,加入0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL、蒸餾水2.5 mL,充分混勻常溫反應5 min后,50%乙醇調(diào)零,700 nm處測定其吸光度值A(chǔ),平行測定三次,取平均值。以終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL VC作陽性對照。吸光度值越大表示還原能力越強。

1.2.7 總抗氧化性測定 使用總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒測定。機體中有很多抗氧化物質(zhì),能使Fe3+還原成Fe2+,后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物,通過520 nm比色可測出其抗氧化能力的高低。

1.2.8 抑制非酶糖基化活性實驗 參照Zhenzhen Ni等[9]、王文君等[10]實驗方法稍作修改,用0.2 mol/L,pH7.4的磷酸緩沖液分別配制濃度為20 mg/mL的牛血清白蛋白及0.5 mol/L葡萄糖。用50%乙醇分別配制初始濃度為0.4、2.0、4.0 mg/mL的樣液。無菌條件下取三種濃度的樣液各1.0 mL,分別與1.0 mL磷酸緩沖液、1.0 mL牛血清白蛋白溶液及1.0 mL葡萄糖溶液混合成樣液終濃度為0.1、0.5、1.0 mg/mL的樣品組,設(shè)三組平行。37 ℃水浴避光孵育,分別在1、2、3、4、5、6、7 d于發(fā)射波長355 nm,激發(fā)波長440 nm下,用熒光分光光度計測定熒光值F。以磷酸緩沖液替代樣液做空白對照,測熒光值F0,以終濃度為0.1 mg/mL的氨基胍作陽性對照。根據(jù)下式計算麥胚黃酮粗提物對AGEs的抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥胚黃酮粗提物對DPPH自由基的清除能力

從圖1可以看出,濃度0.25～2.0 mg/mL范圍內(nèi),麥胚黃酮粗提物對DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而增大。在濃度為2.0 mg/mL 時,DPPH自由基清除率達到86.25%,半抑制濃度IC50值為0.26 mg/mL,可見麥胚黃酮粗提物對DPPH自由基有很強的清除作用。

圖1 麥胚黃酮粗提物對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical-scavenging activities of CFWG

2.2 麥胚黃酮粗提物對羥基自由基的清除能力

圖2表明,麥胚黃酮粗提物對羥基自由基有一定的清除作用,且隨著濃度的增大,清除作用增強。其清除羥基自由基的IC50值為0.78 mg/mL。申勇立等[11]通過研究漆樹黃酮、毛地黃酮等幾種典型黃酮類化合物與羥基自由基的反應機理,發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物能通過不同位置未參與形成分子內(nèi)氫鍵的酚羥基與羥基自由基發(fā)生反應。可見,麥胚黃酮粗提物也同樣具有提供氫質(zhì)子的能力,能起到清除或抑制自由基的作用。

圖2 麥胚黃酮粗提物對羥基自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical-scavenging activities of CFWG

2.3 麥胚黃酮粗提物對超氧陰離子自由基的清除能力

圖3表明,麥胚黃酮粗提物對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力,且清除率與濃度呈線性相關(guān)。在濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi),麥胚黃酮粗提物對超氧陰離子清除率隨濃度增加而顯著增加,0.2 mg/mL時,清除率僅為8.44%,1.0 mg/mL達到45.39%,同濃度下VC對超氧陰離子自由基清除率均在91.07%以上,強于麥胚黃酮粗提物。

圖3 麥胚黃酮粗提物對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.3 Superoxide anion radical-scavenging activities of CFWG

2.4 麥胚黃酮粗提物螯合金屬離子的能力

圖4表明,麥胚黃酮粗提物有較強螯合金屬離子能力,且在濃度0.75～3.0 mg/mL范圍內(nèi),隨著其濃度的增加,螯合能力逐漸增強,在3.0 mg/mL時螯合率達到78.60%,但在3.75 mg/mL時,螯合能力降低到70.31%。這可能與黃酮類化合物在高濃度時表現(xiàn)出抗氧化效果減弱或發(fā)生促氧化作用有關(guān)[12]。此外,從圖中還可以看出,在此濃度范圍內(nèi),EDTA與VC螯合金屬離子能力均隨濃度增大而增強,且EDTA螯合能力相對較強,均在94.32%以上。同一濃度下,麥胚黃酮粗提物螯合金屬離子能力均強于VC而弱于EDTA。

圖4 麥胚黃酮粗提物螯合亞鐵離子的能力Fig.4 Ferric reducing antioxidant power of CFWG

2.5 麥胚黃酮粗提物的還原能力

圖5表明,麥胚黃酮粗提物具有一定的還原能力,是良好的電子供應者,其提供的電子可以使Fe3+還原成Fe2+。在濃度0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi),隨濃度增大,還原能力緩慢增強,兩者呈良好的線性關(guān)系。但與同濃度的VC相比,麥胚黃酮粗提物的還原能力較弱。

圖5 麥胚黃酮粗提物還原能力Fig.5 Reducing capacity of CFWG

2.6 麥胚黃酮粗提物的總抗氧化能力

圖6表明,麥胚黃酮粗提物的總抗氧化能力在0.12～0.60 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,0.60 mg/mL麥胚黃酮粗提物的總抗氧化能力為2.5 U/mL?？梢?麥胚黃酮這一類谷物黃酮,與已報道的植物黃酮一樣,都具有較好的抗氧化性[7-8],具有開發(fā)潛力。

圖6 麥胚黃酮粗提物總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of CFWG

2.7 麥胚黃酮粗提物抑制非酶糖基化活性

圖7表明,麥胚黃酮粗提物對體外蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物有一定的抑制作用,隨時間的延長,熒光強度逐漸增強,抑制率逐漸增大,第2～3 d急劇增大。且隨濃度增大,抑制效果也逐漸增強。濃度為1.0 mg/mL的麥胚黃酮粗提物第7 d對AGEs的抑制率達到了48%,相當于0.1 mg/mL氨基胍第3 d的抑制效果。Xiuyuan Zhuang等人研究多種植物提取物對AGEs形成的抑制作用時發(fā)現(xiàn),黃酮類化合物對AGEs的形成具有較好的抑制效果[3]。本文在發(fā)現(xiàn)麥胚黃酮粗提物在體外具有較好抗氧化性的同時,也首次發(fā)現(xiàn)了其具有抑制AGEs形成的作用。

圖7 麥胚黃酮粗提物對非酶糖基化終末產(chǎn)物AGEs形成的影響Fig.7 Effect of CFWG on non-enzymatic glycation end-products AGEs formation

3 結(jié)論

結(jié)果表明,麥胚黃酮粗提物有較好的抗氧化能力,尤其是對DPPH自由基,具有較強的清除活性。同時其對蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物AGEs形成有一定抑制作用,終濃度為1.0 mg/mL的麥胚黃酮粗提物對AGEs生成的抑制率在第1 d為6.7%,到第7 d達到48.25%。且抗氧化及抑制AGEs能力與麥胚黃酮粗提物在一定濃度范圍內(nèi)均呈明顯的量效關(guān)系。

綜上可見,麥胚黃酮粗提物具有較強的生物活性,尤其是對AGEs的抑制作用,對于緩解AGEs積累引起的糖尿病并發(fā)癥,具有巨大的開發(fā)潛力。

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Study on the antioxidant and inhibiting non-enzyme glycation activities of crude flavonoids from wheat germinvitro

LIU Wan-ling1,LONG Jun-min2,XIAO Jian-hui1,NIU Li-ya1,*

(1.School of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.School of animal science,Jiangxi Biotech Vocational College,Nanchang 330200,China)

In this paper,the antioxidant activities of crude flavonoids from wheat germ(CFWG)invitrowere determined by radical scavenging system(DPPH radicals,hydroxyl radicals,superoxide anion),metal ion chelating ability,reducing power and total antioxidant capacity system. In addition,the inhibiting non-enzymatic glycation reaction of CFWG was also evaluated. The results showed that,with the increasing of concentration,the antioxidant activities of CFWG,such as scavenging DPPH radicals,hydroxyl radicals and superoxide anion radicals ability,and reducing power,total antioxidant capacity were increased. The IC50values of scavenge DPPH radical and hydroxyl radicals were 0.26,0.78 mg/mL,respectively. In concentration of 0.75～3.0 mg/mL,with the concentration increased,its metal ion chelating ability was gradually increased to 78.60%,and when the concentration was 3.75 mg/mL,its metal ion chelating ability was reduced to 70.31%,which was also stronger than VC. Furthermore,CFWG can inhibit the advanced glycation end products(AGEs)invitro,and with the concentration increasing,the inhibitory effect was gradually increasd. In the first seven days,the inhibition rate of 1.0 mg/mL CFWG was up to 48%. In a word,CFWG with strong antioxidant capacityinvitro,can inhibit the formation of AGEs effectively.

crude flavonoids from wheat germ;antioxidant activity;advanced glycation end products

2014-12-15

劉宛玲(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取及其功能性研究，E-mail：liuwanling1990@126.com。

*通訊作者:牛麗亞(1984-)，女，博士，講師，研究方向：功能性食品，E-mail：nly8483@163.com。

國家自然科學基金資助項目(31401484)；江西省青年科學基金計劃(20142BAB214002)。

TS209

A

1002-0306(2015)23-0059-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.003