熊萍香，周玉平，熊江琴，寧 安，周憲民，鄒節(jié)新，楊德平，林智平，胡美英

(1.南昌市第二醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330003； 2.江西省寄生蟲病防治研究所，南昌 330046； 3.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，南昌 330006)

血吸蟲病患者不同胃黏膜病變中Survivin、p53、E-cadherin蛋白表達及臨床意義

熊萍香1，周玉平1，熊江琴1，寧 安2，周憲民3，鄒節(jié)新3，楊德平1，林智平1，胡美英1

(1.南昌市第二醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330003； 2.江西省寄生蟲病防治研究所，南昌 330046； 3.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，南昌 330006)

目的 探討鄱陽湖區(qū)域日本血吸蟲病患者Survivin、p53、E-cadherin的表達及其臨床病理學(xué)意義。方法選擇鄱陽湖區(qū)域確診為慢性與晚期血吸蟲病患者(151例)的胃黏膜標本(其中萎縮性胃炎49例，胃黏膜異形增生30例，不完全性大腸上皮化生34例，胃癌38例)。應(yīng)用組織芯片和免疫組織化學(xué)S-P法檢測Survivin、p53、E-cadherin在正常黏膜、癌前病變、胃癌組織中的表達。結(jié)果 Survivin蛋白在正常胃黏膜組織壁細胞可見陽性表達，而其他細胞幾乎無表達。Survivin蛋白陽性表達率在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌各組分別為51.02%、58.82%、66.67%、86.84%，各組織間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；p53蛋白陽性表達率在正常胃黏膜、萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌各組分別為1.32%、16.33%、58.82%、76.67%、92.11%，各組織間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E-cadherin蛋白在正常胃黏膜表達率為100.00%，在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌各組胃黏膜組織中陽性率分別為83.67%、76.47%、63.33%、26.31%，各組織間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Survivin、p53、E-cadherin蛋白表達與胃癌的組織分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM 分期有關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論 Survivin、p53、E-cadherin蛋白可能參與血吸蟲患者胃癌病變的發(fā)生發(fā)展，可作為較理想的標志物用于胃癌的早期診斷和轉(zhuǎn)移預(yù)后的預(yù)警。

Survivin； p53； E-cadherin； 日本血吸蟲??； 癌前病變； 胃癌

日本血吸蟲病是嚴重危害人類身體健康的寄生蟲病。江西省鄱陽湖區(qū)是我國血吸蟲病重疫區(qū)[1-2]。本課題組前期研究資料[3]表明，血吸蟲病患者合并胃癌前病變(萎縮性胃炎、胃黏膜異形增生、不完全性大腸上皮化生)的發(fā)生率明顯高于非血吸蟲病患者。由于整個胃癌癌前發(fā)展過程是一個非常復(fù)雜的由進行性和退行性變化組成的動態(tài)過程，研究胃癌癌前和早期的基因變化對于了解該病發(fā)生的病理過程、進而提出早期診斷和干預(yù)策略有重要意義。

現(xiàn)代腫瘤學(xué)認為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多個基因突變與異常表達。許多癌基因/抑癌基因表達失衡、細胞凋亡調(diào)控失衡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，單個腫瘤相關(guān)基因發(fā)生的分子事件作用有限。Survivin是迄今研究發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，在人體各種腫瘤組織中均有Suvrvini蛋白的過量表達[4-5]。Survivin可能作為一種癌基因，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤中最常見的一個突變基因，野生型p53 屬于腫瘤抑制基因，而突變型p53 基因抑制細胞凋亡，從而促使細胞惡性轉(zhuǎn)化，允許腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展[6]。E-cadherin 與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系是近年來腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究的熱點。細胞黏附分子E-eadherin蛋白是維持上皮細胞極性及細胞間連接的糖蛋白，其結(jié)構(gòu)和功能的異常可導(dǎo)致細胞間黏附能力減弱，在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[7-8]。

本研究將收集到的鄱陽湖區(qū)域血吸蟲病患者萎縮性胃炎、胃黏膜異形增生、不完全性大腸上皮化生及胃癌組織，利用組織芯片及免疫組織化學(xué)染色檢測癌基因Survivin、p53、E-cadherin的表達。觀察這些基因蛋白在正常黏膜、癌前病變、癌變組織的變化趨勢，并分析其與胃癌相關(guān)病理參數(shù)的關(guān)系，以深入而全面地揭示血吸蟲病患者合并胃癌及癌前病變復(fù)雜的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

選取南昌市第二醫(yī)院消化內(nèi)科于2009年5月至2012年1月期間收集的鄱陽湖區(qū)域確診為慢性與晚期血吸蟲病患者(151例)的胃黏膜標本，男88例，女63例，患者年齡23～78歲，平均56.8歲。所有標本均經(jīng)病理檢查核實，其中萎縮性胃炎49例，胃黏膜異形增生30例，不完全性大腸上皮化生34例，胃癌38例。

選取同一個體胃鏡活檢取得的正常胃黏膜作為對照。參照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)病理學(xué)分類(pTNM)分期系統(tǒng)(2002版)的標準，pTNM分期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。標本使用均有患者的知情同意和醫(yī)院倫理委員會批準。所有病理標本均經(jīng)病理科兩位以上醫(yī)師診斷證實。所有標本均常規(guī)用10%中性甲醛固定，石蠟包埋制片。

1.2 組織芯片制作

HE染色、切片后進行組織形態(tài)學(xué)觀察，確定胃黏膜病變組織的典型部位，并在切片上做好標記，將切片與蠟塊一一對照，在蠟塊相應(yīng)的典型位置做出標記，制備模板蠟塊(2 cm×4 cm)，用針頭在空白蠟塊上打孔(直徑1.5 mm)，并精確地排成微孔陣列。然后用自制特殊針頭穿取供體蠟塊已標記區(qū)域獲取圓柱狀組織芯，再將組織芯轉(zhuǎn)移到受體蠟塊陣列孔內(nèi)，按照病例編號反復(fù)將組織芯整齊有序地安插在空白蠟塊中，制成組織芯片蠟塊。將組織芯片蠟塊以4～6 μm厚連續(xù)切片。

1.3 免疫組織化學(xué)

制作好的組織芯片采用SP法進行免疫組織化學(xué)染色，具體操作按照SP免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進行。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，用已知陽性組織切片作陽性對照。兔抗人p53多克隆抗體、兔抗人Survivin多克隆抗體、兔抗E-cadherin及SP免疫組織化學(xué)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 結(jié)果判定

所有病理切片和組織芯片均由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生在不知病例臨床資料的前提下閱片，結(jié)果不一致時采取協(xié)商統(tǒng)一原則。對每張病理切片在200倍鏡下觀察4個不同視野。按各種陽性細胞占所得細胞總數(shù)的百分比，將其分為4個等級：陽性細胞≤5%為0分，5%<陽性細胞≤25%為1分，25%<陽性細胞≤50%為2分，50%<陽性細胞≤75%為3分，>75%為4分；陽性細胞表達的著色深度按計分方法：基本不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項積分相乘為最終評分。0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+),5～8分為中度陽性(),9～12分為強陽性()。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin蛋白在不同胃黏膜病變中的表達

Survivin蛋白在正常胃黏膜組織中僅壁細胞可見陽性表達，而其他細胞幾乎無表達。在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌患者的胃黏膜組織中均可見Survivin蛋白不同程度表達。Survivin陽性染色主要定位于細胞質(zhì)中，部分定位于細胞核中，為粗細不一的棕黃色顆粒。在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌患者的胃黏膜組織中，Survivin蛋白陽性表達率分別為51.02%、58.82%、66.67%、86.84%，各組織間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 Survivin蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病變組織中的表達

2.2 p53蛋白在不同胃黏膜病變中的表達

在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌患者的胃黏膜組織均可見p53陽性表達。p53陽性著色以細胞核為主，呈棕黃色顆粒狀。p53在正常黏膜組織、萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌的陽性表達率分別為1.32%、16.33%、58.82%、76.67%、92.11%，各組織間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 p53蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病變組織中的表達

2.3 E-cadherin蛋白在不同胃黏膜病變中的表達

正常胃黏膜組織E-cadherin蛋白表達陽性率為100%。E-cadherin主要表達在細胞膜，細胞質(zhì)中有少量表達，呈棕黃色顆粒狀。E-cadherin蛋白在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌的陽性表達率分別為83.67%、76.47%、63.33%、26.31%，各組織間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 E-cadherin蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病變組織中的表達

2.4 Survivin、p53、E-cadherin 蛋白表達與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

Survivin、p53、E-cadherin 蛋白表達與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系見表4。由表4可見，在胃癌黏膜組織中，Survivin、p53、E-cadherin蛋白表達與患者的年齡、性別無明顯關(guān)系(P>0.05)，而與組織學(xué)分化、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期有關(guān)(均P<0.05)。組織分化程度越低，Survivin蛋白、p53蛋白陽性表達率越高，E-cadherin蛋白陽性表達率越低；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，Survivin蛋白、p53蛋白陽性率較高，E-cadherin蛋白陽性表達率低；臨床病理分期越晚，Survivin蛋白、p53蛋白陽性表達率越高，E-cadherin蛋白陽性表達率越低，表明Survivin蛋白、p53蛋白高表達，E-cadherin蛋白低表達提示胃癌不良預(yù)后。

表4 Survivin、p53、E-cadherin 蛋白表達與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

表4(續(xù))

3 討論

血吸蟲病與結(jié)腸癌、肝癌等相關(guān)，已為科學(xué)工作者所共識?；谧匀慌c社會諸多因素的影響，鄱陽湖是我國血吸蟲病流行最為嚴重的區(qū)域之一。本課題組于2009年1月至2010年1月對鄱陽湖血吸蟲疫區(qū)6縣共19個自然村453例自愿者進行胃鏡檢查，并且在胃竇、胃角、胃體和球腔等部位的可疑病灶處取材進行病理檢查，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血吸蟲病患者胃癌的前期病變的發(fā)生率明顯高于非血吸蟲病患者[3]。

胃癌是常見的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)生發(fā)展是個多階段過程，涉及許多基因突變與異常表達，并與細胞凋亡調(diào)控失衡相關(guān)。由于單一腫瘤標志物檢測往往意義較小，難于全面評估。組織芯片為病理學(xué)提供了一種高通量、大樣本以及快速的分子水平的分析工具。構(gòu)建胃癌組織芯片進行多基因表達檢測具有十分重要的意義，并具有明顯優(yōu)勢。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的最新成員，在人類很多惡性腫瘤組織中都可檢測出Survivin的表達[4-5]。有研究[9]顯示，Survivin參與細胞周期調(diào)控，胃癌組織中Suvrivin基因大量表達可能導(dǎo)致凋亡調(diào)控機制失常而發(fā)生凋亡受阻，這將有助于癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提示Survivin可能是一個腫瘤特異性的凋亡抑制因子，很可能成為一個新的腫瘤標記物和腫瘤基因治療的一個理想的靶基因。在本研究中，Survivin蛋白在胃癌前病變及胃癌中的陽性表達率顯著高于正常胃黏膜組織，并且其陽性表達率隨著癌變的進展而顯著增加。同時，本研究結(jié)果也顯示，Suvrvini蛋白表達與組織分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期有關(guān)。組織分化程度越低，Survivin蛋白的表達強度越強，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期越晚，Survivin蛋白陽性表達率越高，提示Survivin蛋白的表達與腫瘤的生物學(xué)特性、疾病分期和患者預(yù)后有關(guān)，Survivin可能是胃癌靶向治療的一個很好的位點。

抑癌基因p53是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類多種腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因。它包括野生型和突變型兩種，其中野生型為腫瘤的抑制基因，突變型為腫瘤的致癌基因，前者的缺失突變或后者的過量表達均可促進腫瘤的發(fā)生。p53蛋白的主要生物學(xué)功能包括引起細胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡和促進分化等[10]。本研究組織芯片結(jié)果顯示，正常胃黏膜p53表達率低，在胃癌前病變和胃癌黏膜組織中均可見p53陽性表達，且隨惡性程度增加呈逐漸升高趨勢。同時，p53陽性表達與胃癌的臨床病理特征關(guān)系的研究表明，p53蛋白表達陽性率在胃癌中隨組織學(xué)分化降低而升高，并且與胃癌浸潤相關(guān)。在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，p53蛋白表達陽性率顯著較高，且隨pTNM分期增高而顯著增加。表明p53基因突變是胃癌惡性轉(zhuǎn)化的重要事件，其陽性表達與胃癌進展的病理形態(tài)學(xué)參數(shù)存在一定的相關(guān)性。

E-cadherin是一種跨膜糖蛋白，具有維持正常上皮完整性和極性的功能，當E-cadherin表達降低或其他因素損害E-cadherin 黏附功能時，腫瘤細胞就易于脫離并逃離原發(fā)灶發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[11-12]。因此，E-cadherin的黏附功能喪失是細胞獲得低分化和高浸潤性的關(guān)鍵。有研究[13]顯示，將E-cadherin反義RNA導(dǎo)入高表達E-cadherin 腫瘤細胞株中，可明顯提高轉(zhuǎn)移力，提示E-cadherin確有腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin蛋白在正常胃黏膜組織中的陽性表達率為100.00%，而在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌的陽性表達率分別為83.67%、76.47%、63.33%、26.31%，表明E-cadherin下調(diào)在胃癌前病變和胃癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，分化程度越差、浸潤越深，E-cadherin的陽性表達在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示其與腫瘤的分化、浸潤性、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由于以上3種因素均為與患者預(yù)后相關(guān)的重要因素，因此，E-cadherin也可作為判斷腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標。

綜上所述，在血吸蟲患者胃癌前病變及胃癌組織中，Survivin、p53、E-cadherin蛋白的變化可能與癌變的發(fā)生發(fā)展、癌細胞的分化、腫瘤的增殖、侵襲及患者的預(yù)后有關(guān)。

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(責任編輯：鐘榮梅)

2014-06-24

國家自然科學(xué)基金(81160207)；江西省衛(wèi)生廳普通科技計劃(贛衛(wèi)科教字【2011】29號)

熊萍香(1962—)，女，學(xué)士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸疾病與消化內(nèi)鏡的研究。

熊江琴，主任醫(yī)師， E-mail：xiongjiangqin@sina.com。

R532.21

A

1009-8194(2015)03-0015-04

10.13764/j.cnki.lcsy.2015.03.006