李 偉， 羅振華， 付凌云， 沈祥春， 吳立榮， 劉興德**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心血管科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州省人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550002； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

·基礎(chǔ)研究·

銀杏提取物對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響*

李 偉1， 羅振華2， 付凌云3， 沈祥春3， 吳立榮1， 劉興德1**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心血管科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州省人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550002； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

目的： 探討銀杏葉提取物(GBE)對(duì)血管緊張素II(AngII)誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法: 分離與培養(yǎng)新生SD大鼠原代心肌細(xì)胞，采用AngII誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡后將細(xì)胞分陰性對(duì)照組(A組，細(xì)胞培養(yǎng)液)、AngII組(B組， AngII 10-5mol/L干預(yù))、ALK5抑制劑組(C組，SB431542 6 mg/L及 AngII 10-5mol/L)、GBE低劑量組(D組，GBE 2 mg/L及AngII 10-5mol/L)及GBE 高劑量組(E組，GBE 20 mg/L及AngII 10-5mol/L)，采用流式細(xì)胞儀和原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL法)檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果： B組心肌凋亡率明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C、D及E組的心肌細(xì)胞凋亡率均降低，其中C組和E組細(xì)胞凋亡率與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論： GBE能夠抑制AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

銀杏葉提取物； 血管緊張素II； 細(xì)胞凋亡； 心室重塑

細(xì)胞凋亡(apoptosis)亦稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，是細(xì)胞在自身基因調(diào)控下的一種主動(dòng)死亡，是組織細(xì)胞必要的代謝過(guò)程。但是，過(guò)度的細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重后果，如心肌梗死后缺血缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡是心室重塑的重要病理原因之一[1]。心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生后，該區(qū)域會(huì)出現(xiàn)壞死、液化及吸收過(guò)程，心室壁會(huì)逐漸變薄，心室進(jìn)行性擴(kuò)張，導(dǎo)致到心室重塑，最后發(fā)生心力衰竭，甚至誘發(fā)患者猝死[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡亦可發(fā)生在急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后非梗死區(qū)[4]。因此，尋找合理有效的防治與逆轉(zhuǎn)心肌重塑的藥物，對(duì)降低AMI病死率有著重要意義。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，GBE)是從銀杏葉中提取的一種混合物，具有獨(dú)特藥理活性，其中黃酮類和萜類內(nèi)酯化合物是銀杏葉提取物的主要有效成分[5]。GBE對(duì)心肌缺血的損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化、擴(kuò)張冠脈血管、改善微循環(huán)、抗自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等作用有關(guān)[6-7]，但目前關(guān)于GBE對(duì)AMI后心肌重塑的抑制或逆轉(zhuǎn)作用國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在觀察GBE對(duì)血管緊張素II(angiotensin II，AngII)誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，為探討GBE對(duì)心肌重塑防治作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境 清潔級(jí)SD雌性大鼠24只，雄性大鼠8只，體重200～250 g,由中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)(IAEC)審查允許，許可證號(hào)SCXK2013-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室恒溫、恒濕。雌、雄大鼠按照3∶1的比例共圈飼養(yǎng)，出生1～3 d的乳鼠作為實(shí)驗(yàn)用鼠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥材 銀杏葉提取物，批號(hào)WGBEXP130918，由貴州省工程中心研究員提供，呈黃色粉末，成分包括總黃酮26.16%(槲皮素醇苷11.06%、山奈素醇苷11.93%、異鼠李素醇苷3.17%)及銀杏總內(nèi)酯6.28%(銀杏內(nèi)酯C1.23%、白果內(nèi)酯1.81%、銀杏內(nèi)酯A2.48%、銀杏內(nèi)酯B0.76%)。

1.1.3 主要試劑與儀器 AngII試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody(美國(guó)life technologies公司)，Anti-cardiac troponin antibody、α-Actin antibody試劑盒(美國(guó)Santa公司)，Annexin V/PI apoptosis kit凋亡檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(瑞士ROCHE公司)，H1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀)，Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 新生SD大鼠原代心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，雌雄皆可，超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作取乳鼠心臟，仔細(xì)剝離心房及大血管組織，留心室組織。將心室組織置于冰浴的PBS中，浸泡洗滌3次，吸凈PBS液后用虹膜剪將心室組織剪成大小約0.5～1 mm3碎塊。加入0.1%胰蛋白酶消化組織碎塊，反復(fù)吹打置37 ℃恒溫水浴搖床消化，5 min/次，消化5～7次，收集每次消化液于10% FBS-DMEM中(第一次消化液棄)。100-200目篩網(wǎng)過(guò)濾，混勻細(xì)胞，1 000 r/min，10 min，用DMEM洗滌，再次混勻細(xì)胞，1 000 r/min，10 min，棄上清將細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中差速貼壁2 h。2 h后收集未貼壁細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中繼續(xù)生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞首次換液，48 h更換無(wú)血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，細(xì)胞生長(zhǎng)同步后做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 新生大鼠心肌細(xì)胞鑒定 將新生大鼠心肌細(xì)胞接種于放置有載玻片的12孔板中，1×105個(gè)/孔，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基同步化后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP染色法鑒定分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，采用培養(yǎng)4 d的原代心肌細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)大鼠心肌肌動(dòng)蛋白(α-Actin)和肌鈣蛋白(cardiac troponin)，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀( FCM)檢測(cè)AngII誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的濃度效應(yīng)關(guān)系 取1～3 d乳鼠按照1.2.1步驟制備原代心肌細(xì)胞，在含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h同步化后，分別加入最終濃度為10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L，10-5mol/L的AngII，給藥后培養(yǎng)48 h。1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，加入10 mol/L PBS (pH=7.2)緩沖液500 μL洗滌3次，棄上清，設(shè)置陰性對(duì)照組(不加染料)。加入1×Binding Buffer 100 μL重懸細(xì)胞，在反應(yīng)體積加入5 Μl FITC探針和10 μL PI探針混勻，4 ℃避光孵育10 min，用BD AccuriTMC6流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率。FITC激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，綠色熒光FL1通道檢測(cè)；PI-DNA復(fù)合物激發(fā)波長(zhǎng)535 nm，發(fā)射波長(zhǎng)615 nm，紅色熒光FL2通道檢測(cè)。用BD AccuriTMC6軟件繪制雙色散點(diǎn)圖，F(xiàn)ITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。每個(gè)樣采集10 000 events。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的最佳濃度為10-5mol/L以該濃度做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)1.2.3中選出的AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的最佳濃度，共分為5組。(1)A組，陰性對(duì)照組，加入藥物同容積的細(xì)胞培養(yǎng)液；(2)B組，AngII組， AngII(10-5mol/L)干預(yù)；(3)C組，SB431542抑制劑作用組，加入SB431542(6 mg/L)及 AngII(10-5mol/L)；(4)D組，GBE低劑量組，加入GBE(2 mg/L)及 AngII(10-5mol/L)；(5)E組，GBE 高劑量組， 加入GBE(20 mg/L)及AngII(10-5mol/L)。

1.2.5 FCM檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡 按照1.2.3步驟，收集各組心肌細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL法)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 按照TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(ROCHE)操作說(shuō)明，采用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞爬片20 min，PBS漂洗2遍；加TUNEL反應(yīng)混合液50 μL于標(biāo)本上，用封口膜密封于暗濕盒中37 ℃反應(yīng)60 min，PBS漂洗3次，每次5 min；加DAB底物50～100 μL，顯微鏡下控制顯色，PBS終止顯色；蘇木精液染色5～10 min后，PBS漂洗2次后中性樹(shù)膠封片，拍照觀察。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，每張切片200倍鏡下選擇10個(gè)陽(yáng)性視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核棕黃色)作為凋亡指數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

倒置顯微鏡下剛分離的心肌細(xì)胞呈圓球形、棒狀，漂浮在培養(yǎng)液中；24 h后細(xì)胞逐漸開(kāi)始向外突起伸展，貼壁后部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)；48 h后細(xì)胞逐漸展開(kāi)，心肌細(xì)胞呈梭形或多角形，含有1～2個(gè)核；72 h后細(xì)胞逐漸形成細(xì)胞簇并出現(xiàn)同步搏動(dòng)，心肌細(xì)胞純度達(dá)90%以上。免疫細(xì)胞化學(xué)SP法染色顯示，陰性對(duì)照可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈梭形或多角形，胞漿無(wú)色，胞核橢圓藍(lán)色(圖1A)；加抗體組可見(jiàn)心肌細(xì)胞染成棕黃色，肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白在胞內(nèi)表達(dá)。免疫染色結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度達(dá)95%以上，符合心肌細(xì)胞的特征(圖1B、C)。

2.2 AngII誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的濃度效應(yīng)關(guān)系

在心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L和10-5mol/L AngII，48 h后流式細(xì)胞儀觀察結(jié)果顯示，隨著AngII濃度的增加，心肌細(xì)胞凋亡率逐漸上升， 10-5mol/L AngII心肌凋亡率最高，為(8.5±0.8)%(圖2)，與對(duì)照比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和參考文獻(xiàn)，選取10-5mol/L為AngII誘導(dǎo)凋亡的最佳濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 FCM檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡

FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，B組心肌凋亡率明顯高于其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明AngII刺激心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡造模成功。用藥物干預(yù)后與B組比較，C、D及E組細(xì)胞凋亡率均降低，C組和E組細(xì)胞凋亡率與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.4 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

通過(guò)TUNEL染色心肌細(xì)胞后鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組心肌細(xì)胞保持正常形態(tài)，呈梭形或多角形，胞質(zhì)呈伸展突起，胞核橢圓形，1～2個(gè)，胞核染色藍(lán)色，胞漿均一染成淺藍(lán)色(見(jiàn)圖4A)；B組貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓和脫落，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，細(xì)胞變小、變圓，細(xì)胞胞漿和胞核染色呈棕黃色，染色體固縮，呈深棕色(見(jiàn)圖4B)；細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)成塊狀，在細(xì)胞胞漿內(nèi)形成圓形、深棕色的凋亡小體(見(jiàn)圖4C)，這些為TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。C、D及E組鏡下可見(jiàn)正常心肌細(xì)胞和少量的凋亡細(xì)胞(圖4D、4E、4F)。與對(duì)照組比較，B、C、D及E組心肌細(xì)胞凋亡率均有所增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C、D及E組細(xì)胞凋亡率均有所下降，其中C組和E組細(xì)胞凋亡率與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：A.陰性對(duì)照組；B.抗肌動(dòng)蛋白染色；C.抗肌鈣蛋白染色

注：與對(duì)照組比較,(1)P<0.05，(2) P<0.01。

注：與對(duì)照組比較,(1)P<0.01；與AngII造模組比較,(2)P<0.05,(3)P<0.01

注：A為A組, B、C為B組,D為C組, E為D組, F為E組

與對(duì)照組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01；與AngII造模組比較,(3)P<0.05,(4)P<0.01

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem, RAS)或腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme, ACE)和血管緊張素Ⅱ受體作為重要效應(yīng)因子參與了腎素-血管緊張素系統(tǒng)的生理調(diào)節(jié)作用，尤其是AngII通過(guò)作用于相應(yīng)組織器官上的受體，起到收縮血管平滑肌等重要作用。研究證實(shí)AngII能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，Kajstura J等[8]描述了在試驗(yàn)大鼠的心肌細(xì)胞中AngII誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。

GBE具有多種藥理學(xué)活性，包括抗氧化及抗炎等，有研究表明銀杏內(nèi)酯B能促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)[9]。銀杏葉提取物作用于阿霉素所致大鼠心肌損傷模型，能起到抗氧化和抗凋亡作用[10-11]。還有研究者發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物作用于缺血/再灌注大鼠模型能顯著抑制心肌Bax、Caspase-3及Cyt-c蛋白的表達(dá)[7]。黃迪南等[12]發(fā)現(xiàn)GBE化學(xué)活性成分EGb761能有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的HeLa 細(xì)胞凋亡；劉彥等[13]發(fā)現(xiàn)GBE能夠?qū)Υ笫笤隗w缺血再灌注的心肌起到保護(hù)作用, 并促使心肌細(xì)胞凋亡的減少。本研究將GBE作用于AngII誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡模型，觀察GBE的抗心肌凋亡作用。在心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L和10-5mol/LAngII，選擇合適濃度制作AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?8 h后用流式細(xì)胞儀觀察每個(gè)濃度心肌細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)隨著AngII濃度的增加，心肌細(xì)胞凋亡率逐漸上升，當(dāng)AngII濃度為10-5mol/L時(shí)心肌凋亡率最高，比對(duì)照組明顯增加，表明AngII可促使心肌細(xì)胞調(diào)亡，選取10-5mol/L AngII為誘導(dǎo)凋亡的最佳濃度。培養(yǎng)48 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞，部分細(xì)胞體積變小，細(xì)胞變圓，部分胞體增大，形態(tài)不規(guī)則呈異型，喪失梭形形態(tài)，自發(fā)搏動(dòng)明顯減弱。TUNEL法觀察造模組貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓和脫落，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，細(xì)胞變小、變圓，細(xì)胞胞漿和胞核染色呈棕黃色，染色體固縮，可見(jiàn)深棕色凋亡小體。加入藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，ALK5抑制劑SB431542能夠有效的抑制AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡；在加入高濃度GBE后，流式細(xì)胞儀以及TUNEL法檢測(cè)結(jié)果均顯示，與AngII造模組比較高濃度GBE藥物作用組的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與AngII抑制劑使凋亡細(xì)胞數(shù)量減少的效果相類似。表明GBE能夠顯著的抑制由AngII引起的心肌細(xì)胞凋亡反應(yīng)， GBE通過(guò)何種途徑抑制AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡，將做進(jìn)一步的研究。

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(2015-05-18收稿，2015-06-30修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 劉 華

The Effect ofGinkgobilobeExtract on Apoptosis of Neonate Rat Cardiac Myocytes Induced by AngII

LI Wei1, LUO Zhenhua2, FU Lingyun3, SHEN Xiangchun3, WU Lirong1, LIU Xingde1

(1.DepartmentofCardiovascularMedicine,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.CentralLaboratory,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China; 3.Collegeofpharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

Objective: To investigate the protective effect ofGinkgobilobaextract (GBE) on apoptosis of neonate rat cardiac myocytes induced by AngII. Methods: The neonate SD rat primary culture cardiac myocytes were separated and cultured. The injury of rat primary culture cardiac myocytes (RPCCM) was induced by AngII, and then incubated with GBE and ALK5 inhibitor. The experimental groups were randomly divided into 5 groups as following: group A: negative control group, the RPCCM+equality volume culture medium, group B: AngII group, RPCCM+AngII (10-5mol/L), group C: SB431542 inhibitor action group, RPCCM+SB431542 (ALK5 inhibitor, 6 g/mL) + AngII (10-5mol/L), group D: GBE low dose group, RPCCM+GBE (2 mg/L) + AngII (10-5mol/L), group E: GBE high dose group, RPCCM+GBE (20 mg/L) + AngII (10-5mol/L). The apoptotic morphology was detected by HE staining in the cardiac myocytes induced by AngII, and the cardiac myocytes apoptosis were detected by flow cytometry and TUNEL staining. Results: The myocardial apoptosis rate in group B (AngII group) was significantly higher than that in other groups(P<0.05). Compared with group B, the myocardial apoptosis rate in group C, group D and group E were decreased, and there was statistical significance between group C, group E and group B(P<0.01). Conclusion: GBE can significantly inhibit apoptosis induced by AngII and protect myocardial cells.

Ginkgobilobaextract; angiotensin II; apoptosis; ventricular remodeling

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81173586)； 貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目[No.黔科合SY 字(2011)3011號(hào)]

時(shí)間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2242.016.html

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A

1000-2707(2015)09-0910-05

**通信作者 E-mail:lxd@gmc.edu.cn