談潘莉徐 雯曹 毅

·論 著·

黃根醇提取物體外抗白色念珠菌生物膜作用的實(shí)驗(yàn)研究

談潘莉1徐 雯2曹 毅1

目的 觀察黃根醇提取物體外對(duì)白色念珠菌生物膜及相關(guān)基因的影響。方法 M27－A2測(cè)定黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度（MIC）；XTT法評(píng)價(jià)黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響；實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR（qRT－PCR）檢測(cè)黃根醇提取物作用后，ALS基因的表達(dá)情況。結(jié)果 黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌的MIC為8μg/mL；隨著濃度的增加，黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜的抑制作用增強(qiáng)，呈正相關(guān)性；16μg/mL黃根醇提取物對(duì)不同生長(zhǎng)階段的白色念珠菌生物膜均有抑制作用，抑制率隨生物膜成熟逐漸降低；qRT－PCR結(jié)果顯示，藥物作用后ALS2、ALS3基因表達(dá)降低（7.87±0.27比5.15±0.34；6.24±0.51比2.13±0.23，P＜0.05），ALS1基因表達(dá)無(wú)明顯變化（6.11±0.14比5.95±0.31，P＞0.05）。結(jié)論 黃根醇提取物對(duì)體外白色念珠菌生物膜有較明顯的抑制作用，可能通過抑制ALS2、ALS3基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

白色念珠菌；黃根醇提取物；RT－PCR

隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等的廣泛應(yīng)用，免疫受損人群不斷增加，條件致病真菌中念珠菌的感染率日漸升高[1－2]，其中白色念珠菌（candida albicans）是臨床最常見的致病真菌，在機(jī)體免疫功能低下時(shí)，可引起黏膜和全身性的感染[3]。白色念珠菌對(duì)傳統(tǒng)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性是治療此類感染的難點(diǎn)。研究顯示，真菌的耐藥性與生物膜有著密切關(guān)聯(lián)[4]。尋找抗真菌生物膜的藥物是防治真菌病的關(guān)鍵。黃根為茜草科植物三角瓣花（prismatomeriste-trandra）的根，性微苦，味涼，具有軟堅(jiān)散結(jié)、涼血止血、祛瘀生新、強(qiáng)壯筋骨和利濕退黃等功效[5]。廣西民間多用以治療慢性肝炎，有文獻(xiàn)報(bào)道用乙醇回流提取的黃根制劑還具有抗菌作用[6]。本研究就黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜形成及相關(guān)基因表達(dá)的影響進(jìn)行初步研究，以期為白色念珠菌生物膜的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌 株 ATCC10231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

1.2 藥物及試劑 黃根醇提取物的制備：將黃根粉碎成粗粉，用乙醇加熱回流提取兩次，合并提取液，濾過，濃縮至無(wú)醇味，于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫籜TT粉末：Sigma公司；維生素K3：Alexis公司；丙酮：蚌埠化學(xué)試劑廠；RPMI-1640培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)配制[7]。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 最小抑菌濃度 黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MIC）值測(cè)定采用國(guó)際上通用的微量稀釋法，即美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）M27-A2[8]。

2.2 白色念珠菌生物膜制備 將白色念珠菌接種于YPD培養(yǎng)基中，35°C搖床過夜培養(yǎng)，收集菌體，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，調(diào)整菌液濃度為1×106菌落形成單位/毫升（CFU/mL）。將100μL該濃度菌液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)2h后棄去培養(yǎng)基，用pH7.4、0.01mol/L磷酸緩沖鹽水（PBS）洗3次，加入100μL RPMI-1640培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)的0點(diǎn)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)，每24h更換1次培養(yǎng)基。

2.3 不同濃度黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜影響 在生物膜培養(yǎng)的0點(diǎn)，加入倍比稀釋的黃根醇提取物溶液（終濃度分別為2～64μg/mL），空白對(duì)照孔加入培養(yǎng)基，37°C繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，用XTT減低法測(cè)定不同濃度黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜的抑制作用：XTT用0.5g/L林格液稀釋及0.22μm孔徑的濾器過濾除菌，分裝后存放于-70°C冰箱備用。臨用前，加入維生素K3（menadione，用丙酮稀釋至終濃度10mmol/L）。取XTT-menadione溶液100μL加到已形成生物膜的培養(yǎng)孔中（menadione在XTT中的終濃度為1μmol/L）。37°C避光孵育2h后，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm處檢測(cè)各孔光密度（optical density，OD）值，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 黃根醇提取物對(duì)不同生長(zhǎng)階段白色念珠菌生物膜的影響 將100μL菌液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別在生物膜培養(yǎng)的0、4、8、12、24和48h時(shí)棄去培養(yǎng)基，加入黃根醇提取物，使其終濃度為16μg/ mL，空白對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，37°C繼續(xù)培養(yǎng)24h。XTT法測(cè)量各孔在490nm處的OD值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜相關(guān)基因影響

2.5.1 樣品制備 將白色念珠菌接種于YPD培養(yǎng)基中，35°C搖床過夜培養(yǎng)，收集菌體，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，調(diào)整菌液濃度為1×106CFU/mL，將80mL菌液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37°C靜置黏附90min，棄上清液，用滅菌PBS緩沖液洗3次，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入黃根醇提取物，使得其終濃度為16μg/ mL，37°C繼續(xù)靜置培養(yǎng)1h，棄上清液，用滅菌PBS緩沖液洗3次，用生物被膜刮刀刮取細(xì)胞培養(yǎng)皿底部細(xì)胞，收集離心，用DEPC水洗1次，離心并棄上清備用。

2.5.2 RNA提取 取沉淀用Novelase消化液懸浮，室溫消化10min后，參照Trizol試劑（Invitrogen）說(shuō)明書介紹的步驟提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定其RNA濃度[9]。

2.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）引物 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]的ALS1、ALS2、ALS3基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)白色念珠菌ALS1-mRNA、ALS2-mRNA、ALS3-mRNA和18S-RNA的qRT-PCR引物（表1），各引物由上海Invitrogen公司合成。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

2.5.4 qRT-PCR定量分析 以1μg總RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）、SYBR Premix Ex. TaqTM熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa）、上述引物及ABI-7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)ALS1-mR－NA、ALS2－mRNA、ALS3－mRNA，反應(yīng)參數(shù)：95℃30s；95℃5s、60℃30s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因測(cè)3個(gè)復(fù)管，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)中以18S－RNA為內(nèi)參照，采用ΔΔCt模型及REST2005軟件對(duì)qRT－PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析[11]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 黃根醇提取物最小抑菌濃度 黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌最小抑菌濃度（MIC）為8μg/mL。

3.2 不同濃度黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響 黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜的形成具有抑制作用，呈濃度相關(guān)性，抑制率隨著黃根醇提取物濃度增高而增高，各濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同濃度黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜形成的相對(duì)抑制率（±s，n=9）

表2 不同濃度黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜形成的相對(duì)抑制率（±s，n=9）

黃根醇提取物濃度（μg/mL）2481 6 32 64抑制率（%）18.20±1.12 30.51±0.97 41.35±0.45 62.09±0.81 78.41±0.67 87.64±0.75

3.3 黃根醇提取物對(duì)不同生長(zhǎng)階段白色念珠菌生物膜的影響 16μg/mL黃根醇提取物對(duì)不同生長(zhǎng)階段的白色念珠菌生物膜均有抑制作用，且呈時(shí)間相關(guān)性，抑制率隨生物膜成熟逐漸降低，各生長(zhǎng)階段組間有顯著性差異（P＜0.05），見表3。

表3 黃根醇提取物對(duì)不同生長(zhǎng)階段白色念珠菌生物膜的影響（±s）

表3 黃根醇提取物對(duì)不同生長(zhǎng)階段白色念珠菌生物膜的影響（±s）

生長(zhǎng)階段（h）0481 2 24 48抑制率（%）79.51±0.33 67.81±1.21 59.27±0.98 53.71±1.05 47.23±0.77 39.11±0.51

3.4 黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜相關(guān)基因影響 16μg/mL黃根醇提取物作用后，ALS2、ALS3基因表達(dá)水平明顯低于藥物作用前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ALS1基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），見表4。

表4 16μg/mL黃根醇提取物作用前后ALS基因表達(dá)水平的變化（±s，n=9）

表4 16μg/mL黃根醇提取物作用前后ALS基因表達(dá)水平的變化（±s，n=9）

觀察時(shí)間黃根醇提取物作用前黃根醇提取物作用后P mRNA水平ALS1 6.11±0.14 5.95±0.31＞0.05 ALS2 7.87±0.27 5.15±0.34＜0.05 ALS3 6.24±0.51 2.13±0.23＜0.05

4 討論

白色念珠菌（candida albicans）是人類最常見的條件致病菌，可導(dǎo)致深部感染危及生命。該菌容易在各種生物材料表面形成生物被膜。有文獻(xiàn)報(bào)道，白色念珠菌形成生物被膜后對(duì)臨床常用抗白色念珠菌藥物如氟康唑、兩性霉素B等的敏感性下降幾十倍、幾百倍[12－13]。生物膜內(nèi)的念珠菌比浮游菌更加耐藥、難治、所致感染易復(fù)發(fā)[14]。尋求抗生物膜的藥物顯得至關(guān)重要。

Chandra等[15]發(fā)現(xiàn)白色念珠菌生物膜的形成分為3個(gè)階段：早期（0－11h），中期（12－30h）和成熟期（38－72h）。早期的黏附尤為重要，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生物膜逐漸發(fā)育成熟，故抑制黏附是抗白色念珠菌生物膜感染的關(guān)鍵措施。本研究選取具有較強(qiáng)生物膜形成功能的白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231為標(biāo)準(zhǔn)菌株[16]，發(fā)現(xiàn)黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌的早期黏附有明顯的抑制作用，抑制率與濃度呈正相關(guān)，當(dāng)黃根醇提取物濃度達(dá)到16μg/mL時(shí)，抑制率明顯提高，故選取16μg/mL黃根醇提取物作用于不同時(shí)期（0～48h）白色念珠菌生物膜，發(fā)現(xiàn)其對(duì)不同生長(zhǎng)階段的白色念珠菌生物膜均有抑制作用，提示黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物膜的發(fā)育有明顯的干預(yù)作用。由此推測(cè)其抑制白色念珠菌生物膜的作用可能與其抑制細(xì)胞黏附過程相關(guān)。

為從分子機(jī)制角度進(jìn)一步闡述黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌黏附抑制作用，我們檢測(cè)了ALS基因家族中具有代表性的黏附相關(guān)基因 ALS1、ALS2、ALS3。ALS基因是編碼白色念珠菌細(xì)胞壁表明大分子糖蛋白的一組基因，ALS基因家族至少包含8個(gè)基因（ALS1－7，ALS9），其表達(dá)產(chǎn)物Alsp屬錨定蛋白，在生物膜形成的初期即黏附階段發(fā)揮重要作用[17]，與白色念珠菌細(xì)胞和宿主之間的黏附有密切關(guān)系。有研究表明，ALS基因家族的表達(dá)產(chǎn)物大多參與了生物膜形成。O’Connor等[18]在醫(yī)用硅膠上構(gòu)建白色念珠菌生物膜，用實(shí)時(shí)定量RT－PCR方法檢測(cè)到ALS1表達(dá)上調(diào)；Zhao等[19]研究認(rèn)為，ALS2在白色念珠菌從酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)換中可能發(fā)揮一定作用。在體外條件下，ALS3缺失菌株對(duì)人類重組細(xì)胞的黏附能力幾乎完全喪失，不能形成結(jié)構(gòu)完整的被膜[20]。本研究qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃根醇提取物作用后，ALS2、ALS3表達(dá)下調(diào)，ALS1則未見明顯變化。Nailis等[21]利用CDC生物膜反應(yīng)器構(gòu)建了連續(xù)流動(dòng)條件下的生物膜，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ALS1在生物膜形成早期（0.5、1、6h）的表達(dá)無(wú)明顯變化，后期（72、96h）則表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中黃根醇提取物與白色念珠菌生物膜的作用時(shí)間為1h，即屬于早期黏附階段，故ALS1表達(dá)無(wú)明顯變化，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)ALS2、ALS3是黃根醇提取物的主要作用基因，從而導(dǎo)致對(duì)黏附作用的抑制。

［1］Perlroth J，Choi B，Spellberg B.Nosocomial fungal infections：epidemiology，diagnosis，and treatment［J］.Med Mycol，2007，45（4）：321-346.

［2］Wilson D，Thewes S，Zakikhany K，et al.Identifying infection-associated genes of Candida albicans in the postgenomic era［J］.FEMS Yeast Res，2009，9（5）：688-700.

［3］Seneviratne CJ，Wang Y，Jin L，et al.Candida albicans biofilm formation is associated with increased anti-oxidative capacities［J］.Proteomics，2008，8（14）：2936-2947.

［4］Donlan RM，Costerton JW.Biofilms：survival mechanisms of clinically relevant microorganisms［J］.ClinMicrobiol Rev，2002，15（2）：167-193.

［5］廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生局.廣西本草選編（下冊(cè)）［M］.南寧：廣西人民出版社，1974：1790-1791.

［6］Rukayadi Y，Han S，Yong D，et al.In vitro activity of xanthorrhizol against Candida glabrata，C.guilliermondii，and C. parapsilosis biofilms［J］.Med Mycol，2011，49（1）：1-9.

［7］Ramage G，Walle KV，Wickes BL，et al.Standardized Method for In Vitro Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms［J］.Antimicrob Agents Chemother，2001，45（9）：2475-2479.

［8］Mayer I，Layani JD，Givan A，et al.Laions in precipitated hydroxyapatites［J］.J InorgBiochem，1999，73（4）：221-226.

［9］Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning，a latoratory manual［M］.2ed，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：1.21-1.52，2.60-2.80，7.30-7.35，9.14-9.22.

［1 0］Green CB，Chenq G，Chandra J，et al.RT-PCR detection of Candida albicans ALS gene expression in the reconstituted human epithelium（RHE）model of oral candidiasis and in model biofilms［J］.Microbiology，2004，150（2）：267-275.

［1 1］Pfaffl MW，Horgan GW，Dempfle L.Relative expression software tool（REST）for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR［J］.Nucleic Acids Res，2002，30（9）：e36-45.

［1 2］Tobudic S，Lassnigg A，Kratzer C，et al.Antifungal activity of amphotericin B，caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases［J］.Mycoses，2010，53（3）：208-214.

［1 3］Ramage G，Jose A，Coco B，et al.Commercial mouthwashes are more effective than azole antifungals against Candidaalbicans biofilms in vitro［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral RadiolEndod，2011，111（4）：456-460.

［1 4］Ramage G，Vandewalle K，Wickes BL，et al.Characteristicsof biofilm formation by Candida albicans［J］.Rev Iberoam-Micol，2001，18（4）：163-170.

［1 5］Chandra J，Kuhn DM，Mukherjee PK，et al.Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans：development，architecture，and drug resistance［J］.J Bacteriol，2001，183（18）：5385-5394.

［1 6］He M，Du M，F(xiàn)an M，et al.In vitro activity of eugenol against Candida albicansbiofilms［J］.Mycopathologia，2007，163（3）:137-143.

［1 7］Hoyer LL，Green CB，Oh SH，et al.Discovering the secrets of the Candida albicans agglutinin-like sequence（ALS）gene family-a sticky pursuit［J］.Med Mycol，2008，46（1）：1-15．

［1 8］O’Connor L，Lahiff S，Casey F，et al.Quantification of ALS1 gene expression in Candida albicans biofilms by RT-PCR using hybridisation probes on the LightCycler［J］.Mol Cell Probes，2005，19（3）：153-162.

［1 9］Zhao X，Oh SH，Yeater KM，et al.Analysis of the CandidaalbicansAls2p and Als4padhesionssuggests the potential for compensatoryfunctionwithintheAlsfamily［J］.Microbiology，2005，151（5）：1619-1630.

［2 0］Zhao X，Daniels KJ，Oh SH，et al.Candida albicans Als3p is required for wild-type biofilm formation on silicone elastomer surfaces［J］.Microbiology，2006，152（8）：2287-2299.

［2 1］Nailis H，Vandenbroucke R，Tilleman K，et al.Monitoring ALS1 and ALS3 gene expression during in vitro Candida albicans biofilm formation under continuous flow conditions［J］.Mycopathologia，2009，167（1）：9-17.

（收稿：2014-10-30 修回：2014-11-05）

Alcohol Extract from Prismatomeris Tetrandra against Candida Albicans Biofilms in Vitro

TAN Panli1,XUWen2,CAO Yi1. 1 The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China;2 Xiaohe Hushu Community Health Service Center of Gongshu District,Hangzhou(310011),China

Objective To study the effect of alcohol extract from Prismatomeris tetrandra on candida albicans（C. albicans）biofilms and the expression of related genes in vitro.Methods M27－A2 was used to determine the minimum inhibitory concentration（MIC）of alcohol extract from Prismatomeris tetrandra against C.albicans.XTT assay was performed to determine the effects of alcohol extract from Prismatomeris tetrandraon C.albicans biofilm formation.The real－time fluorescent quantitative RT－PCR（qRT－PCR）was used to determine the difference of ALS gene expression between before and after alcohol extract from Prismatomeris tetrandra induction group.Results MIC of alcohol extract from Prismatomeris tetrandra against C.albicans was 8μg/mL.With increasing concentration,the inhibitory effect of alcohol extract from Prismatomeris tetrandra on C.albicans biofilms enhanced.Alcohol extract from Prismatomeris tetrandra at concentration of 16μg/mL showed distinct inhibitive effect on adhesion to C.albicans cultured for 4h,8h,12h,24h and 48h,and the effect weakened as the time of culture increased.qRT－PCR results showed that alcohol extract from Prismatomeris tetrandra resulted in a striking down－regulation of ALS2 and ALS3（ALS2：7.87±0.27 vs 5.15±0.34;ALS：6.24±0.51 vs 2.13±0.23;all P＜0.05）,while the expression of ALS1 showed no changes（6.11±0.14 vs 5.95±0.31,P＞0.05）.Conclusion Alcohol extract from Prismatomeris tetrandra has potent activity against C.albicans biofilms in vitro.The inhibition of alcohol extract from Prismatomeris tetrandra on biofilms formation may depend on suppressing the expression of ALS2 and ALS3.

Candida albicans;alcohol extract from Prismatomeris tetrandra;RT－PCR

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81173271）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科（談潘莉）、皮膚科（曹毅）（杭州 310006）；2杭州市拱墅區(qū)小河湖墅街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心（杭州 310011）

曹毅，Tel：13588887388；E－mail：caoyi1965@163.com