鄭 杰，劉 霜，羅 斌，字向東

(西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041)

山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析及組織表達研究

鄭 杰，劉 霜，羅 斌，字向東

(西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041)

分別提取處于同一發(fā)情周期的5只低繁藏山羊和5只高繁金堂黑山羊的卵巢、垂體的總RNA，并通過RT-PCR技術對INHA、INHBA基因cDNA進行克隆、序列分析，以Real-time PCR技術對其進行組織表達研究.結果表明:藏山羊和金堂黑山羊INHA基因編碼區(qū)均長1083bp，編碼360個氨基酸，兩品種基因編碼區(qū)有7處堿基不同，并導致3處氨基酸的差異;INHBA基因編碼區(qū)均長1278bp，編碼425個氨基酸，兩品種基因編碼區(qū)有4處堿基不同，并導致1處氨基酸的差異.藏山羊INHA基因編碼區(qū)核苷酸序列與金堂黑山羊、綿羊、牛、野豬、小鼠、褐家鼠、人的同源性分別為:99.4%、98.9%、95.8%、88.6%、81.0%、79.5%和84.8%;藏山羊INHBA基因編碼區(qū)核苷酸序列與金堂黑山羊、綿羊、牛、野豬、小鼠、褐家鼠、人的同源性分別為:99.7%、99.4%、98.1%、91.7%、88.0%、88.5%和91.2%.INHA和INHBA基因mRNA在兩個山羊品種的卵巢、垂體中均有表達，但兩品種間無顯著性差異(P＞0.05).說明INHA和INHBA基因在動物進化中比較保守，與山羊多羔性狀的相關性有待進一步研究.

藏山羊;金堂黑山羊;INHA;INHBA;多羔性狀

抑制素(inhibin，INH)是由睪丸支持細胞和卵巢顆粒細胞分泌的一種大分子糖蛋白激素，屬于TGF-β家族成員［1］.抑制素有 α(INHA)、βA(INHBA)和 βB(INHBB)三種類型的亞基基因［2］，是由 α、β 兩個亞基通過二硫鍵連接形成的異二聚體，可協(xié)同激活素通過內(nèi)、旁和自分泌途徑特異性抑制垂體前葉合成和分泌促卵泡素(FSH)，進而影響雌性動物卵泡的發(fā)育和排卵的數(shù)量［3-4］.抑制素可促進促黃體生成素(LH)的分泌，但劑量高于界定值時會抑制LH的分泌［5］.在雄性動物中，抑制素可抑制精子的發(fā)生過程并降低睪丸的生精能力，使精液的生成量減少，也有刺激睪丸間質細胞產(chǎn)生睪酮的作用，從而影響哺乳動物的繁殖性能［6-7］.許多研究結果表明，抑制素與FSH呈負相關關系，對動物體內(nèi)卵泡發(fā)育具有反饋調節(jié)作用，所以可推斷出抑制素是動物體排卵數(shù)的原始信號并且調控FSH的分泌［8］，已被作為與動物繁殖性能相關的候選基因［9-13］.目前國內(nèi)外關于抑制素對綿羊繁殖力影響的研究較多，但對山羊繁殖力影響的研究不多.

藏山羊廣泛分布在青藏高原，其產(chǎn)乳和繁殖性能較低，性成熟較晚.母羊多一年一胎，每胎多產(chǎn)1羔，產(chǎn)羔率約為110%［14］.金堂黑山羊是經(jīng)長期群選群育形成的優(yōu)良地方山羊品種，主要分布在成都市金堂縣及周邊，具有多胎、繁殖力高等特點［15］.山羊的產(chǎn)羔數(shù)是山羊生產(chǎn)中具有巨大經(jīng)濟效益的繁殖性狀，其遺傳力較低(0.05～0.15)［16］，所以常規(guī)的選育方法效果不明顯，進展緩慢.因此尋找影響山羊多胎性的主效基因，提高山羊的產(chǎn)羔數(shù)，對于提高山羊產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益具有重大的意義.故本研究通過對單胎山羊品種藏山羊與多胎山羊品種金堂黑山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析、組織表達分析，以探索INHA和INHBA基因在山羊卵母細胞形成中可能發(fā)揮的作用，以期為研究山羊多胎機制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

本試驗分別在四川省理縣和金堂縣選取藏山羊和金堂黑山羊各5只.對選取的10只母山羊同時進行同期發(fā)情處理［17］:首先把孕酮陰道栓(CIDR)牢固塞入山羊陰道內(nèi)，避免掉落，再經(jīng)10天后選擇肌肉注射氯前列醇鈉(Merck Animal Health，Canada)2mL，第二天取出CIDR.最后將取出CIDR的母山羊經(jīng)40h后進行屠宰，并立即進行樣品采集，用已做好標記的冷凍管裝好采集的卵巢、垂體等組織，投入到液氮罐中保存.

1.2 主要試劑和載體

DNA Marker DL2000、2×Taq PCR MasterMix購自上海天根生物科技有限公司;E.coli DH5α感受態(tài)細胞購自康迪生物技術有限公司;克隆載體pMD-19 Vector、IPTG、X-Gal、氨芐青霉素均購自大連寶 Taka-Ra生物工程有限公司;反轉錄試劑盒購自Fermentas(MBI)公司;SsoAdvancedTMSYBRGreen Supermix購自伯樂公司;DNA凝膠回收試劑盒購自康寧生命科學(吳江)有限公司;引物合成與測序由成都擎科梓熙生物技術有限公司完成.

1.3 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

采用Trizol法提取金堂黑山羊和藏山羊2種組織(卵巢、垂體)的總RNA.用Fermentas(MBI)公司的試劑盒進行cDNA第一鏈的合成.

1.4 引物設計和PCR擴增

根據(jù)選用的NCBI上已發(fā)表的INHA、INHBA的基因序列，利用Primer Premier 5設計克隆引物，引物序列見表1.PCR擴增程序:95℃預變性5 min;95℃變性45s，57℃(INHA)、58℃ (INHBA)退火 40s，72 ℃ 延伸120s，32個循環(huán);最后72℃延伸5 min;4℃保存.

表1 克隆引物序列Table 1 Primer pairs for cloning

1.5 INHA、INHBA基因的克隆和測序

首先用含有GoldView的1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，再經(jīng)DNA膠回收試劑盒對其進行回收.將 0.5μL pMD-19Vector、4.5μL 純化回收產(chǎn)物和5μL Solution于16℃金屬浴中反應過夜，保證連接徹底.連接后的產(chǎn)物再轉化100μL宿主菌E.coli DH5α感受態(tài)細胞，然后經(jīng)冰浴、熱激活等步驟后均勻涂布于含有0.1%的氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，涂布至干后封口倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h.在超凈工作臺中，用滅菌槍頭挑取白色單克隆菌落于含有Amp(濃度為0.1%)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180rpm震蕩培養(yǎng)6～8h至菌液渾濁.取0.5μL菌液作為模板進行PCR擴增反應及電泳檢測鑒定后，最后挑選含目的基因片段的陽性單克隆菌液送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序.

1.6 INHA、INHBA基因的生物信息學分析

利用 DNAstar、DNAman等軟件對相應物種的INHA、INHBA基因序列進行序列對比和同源性比對，利用Clustal X、MEGA 6.0生物軟件構建核苷酸系統(tǒng)發(fā)生樹.

1.7 實時熒光定量PCR擴增

根據(jù)已測序得到的山羊INHA、INHBA的基因序列設計定量引物，引物序列見表2.

表2 定量引物序列Table 2 Primer pairs for qPCR

對藏山羊、金堂黑山羊的卵巢、垂體中的INHA、INHBA基因及內(nèi)參β-actin基因mRNA表達量進行實時熒光定量 PCR檢測.反應條件為:95℃預變性3min;95℃變性10s，INHA、INHBA退火溫度分別為60℃ /20s、58℃ /20s，65℃ 延伸 5s，40 個循環(huán);65℃ 延伸5min;4℃保存.每個樣品設置3個重復，并設置陰性對照.實驗結果采用 Pfaffl法［18］分析INHA、INHBA基因分別在兩種山羊不同組織中的相對表達量，計算公式為:

其中:Eref表示內(nèi)參基因的擴增效率;Etarget表示目的基因的擴增效率;△Ct1表示對照樣本中目的基因的CT值與實驗樣本中目的基因CT值之差，△Ct2表示對照樣本中內(nèi)參基因的CT值與實驗樣本中內(nèi)參基因的CT值之差.

2 結果與分析

2.1 INHA、INHBA基因PCR擴增結果

用1%瓊脂糖凝膠電泳對藏山羊和金堂黑山羊INHA、INHBA基因PCR產(chǎn)物進行檢測.結果如圖1、圖2所示，其中INHA和INHBA基因的目的條帶清晰明亮，與預期大小基本相符，且無雜帶和拖尾現(xiàn)象，可進行下一步實驗.

圖1 INHA基因PCR產(chǎn)物電泳檢測泳道1為藏山羊INHA基因;泳道2為金堂黑山羊INHA基因;泳道M為DNA Marker DL2000Fig.1 Electrophoresis results of INHA PCR product

圖2 INHBA基因PCR產(chǎn)物電泳檢測泳道1為藏山羊INHBA基因;泳道2為金堂黑山羊INHBA基因;泳道M為DNA Marker DL2000Fig.2 Electrophoresis results of INHBA PCR product

2.2 INHA、INHBA基因核苷酸序列比對

藏山羊和金堂黑山羊INHA基因編碼區(qū)均長1083bp，編碼360個氨基酸，兩品種基因編碼區(qū)有7處堿基不同，并導致了3處氨基酸的差異.INHBA基因編碼區(qū)均長1278bp，編碼425個氨基酸，兩品種基因編碼區(qū)有4處堿基不同，并導致了1處氨基酸的差異(表3).

表3 藏山羊和金堂黑山羊INHA、INHBA基因序列差異Table 3 Sequence variations of INHA and INHBA genes in Tibetan goat and Jintang black goat

2.3 INHA、INHBA基因編碼區(qū)核苷酸序列同源性比對

通過DNAstar生物軟件對藏山羊與金堂黑山羊、綿羊、牛、野豬等其他物種INHA、INHBA基因CDs區(qū)核苷酸序列進行比對，分析其同源性.藏山羊INHA基因CDs區(qū)核苷酸序列與金堂黑山羊、綿羊(NM_001308579)、牛(NM_174094)、野豬(NM_214189)、小鼠 (NM010564)、褐 家 鼠 (NM_012590)、人(NM002191)的同源性分別為:99.4%、98.9%、95.8%、88.6%、81.0%、79.5%和84.8%;藏山羊INHBA基因CDs區(qū)核苷酸序列與金堂黑山羊、綿羊(NM_001009458)、牛(NM_174363)、野豬(NM_214028)、小鼠(NM_008380)、褐家鼠(NM_017128)、人(NM_002192)的同源性分別為:99.7%、99.4%、98.1%、91.7%、88.0%、88.5%和91.2%.

2.4 INHA、INHBA基因系統(tǒng)發(fā)生樹的構建

利用Clustal X、MAGA6.0軟件構建INHA和INHBA基因的Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3、圖4).由圖3、圖4可知，藏山羊與金堂黑山羊二者都是先聚為一類，再依次與綿羊、牛、野豬、人聚為一類，最后與小鼠、褐家鼠聚為一類.系統(tǒng)發(fā)生樹的構建結果與核苷酸同源性比對結果一致，與哺乳動物進化程度相符合.

圖3 INHA基因的核苷酸系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree based on a nucleotide alignment of INHA

圖4 INHBA基因的核苷酸系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4 Phylogenetic tree based on a nucleotide alignment of INHBA

2.5 目的基因組織表達差異分析

本實驗通過實時熒光定量PCR技術，以β-actin基因為參照，檢測INHA和INHBA基因在藏山羊和金堂黑山羊不同組織間的mRNA表達量，結果表明:INHA和INHBA的mRNA在山羊卵巢、垂體中均有表達，但兩個品種間mRNA表達量無顯著性差異(P＞0.05，圖5 和圖6).

圖5 INHA基因在藏山羊和金堂黑山羊不同組織中的相對表達量(Mean±SE)Fig.5 Expression of Tibetan goat and Jintang black goat INHA gene in different tissues(Mean±SE)

圖6 INHBA基因在藏山羊和金堂黑山羊不同組織中的相對表達量(Mean±SE)Fig.6 Expression of Tibetan goat and Jintang black goat INHBA gene in different tissues(Mean±SE)

3 討論

目前，大量的研究已證明抑制素對FSH具有調節(jié)作用，但對抑制素的作用機理及其受體的研究還存在較大爭議［8，19］.由于抑制素能夠有效的抑制垂體合成和分泌FSH，而FSH作為影響動物繁殖性能的主要激素之一，其分泌量的高低會直接影響到動物排卵量的多少，所以抑制素被作為動物繁殖性能的候選基因［20］.滑國華等［21］對山羊抑制素 INHA 進行 HaeⅡ酶切，對其編碼區(qū)進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)G等位基因可能與山羊高產(chǎn)性狀呈正相關，并且INHA可能是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的一個主效基因.有研究報道，INHA基因的一個突變導致了關中山羊等三個山羊品種內(nèi)不同基因型間產(chǎn)羔數(shù)的差異［22］.Jaeger等［23］研究表明，INHBA對綿羊產(chǎn)羔數(shù)具有顯著影響.索峰等［24］也發(fā)現(xiàn)INHBA基因是影響巴美肉山羊產(chǎn)羔數(shù)的重要基因.劉月琴等［25］在對太行山羊進行了抑制素的主動免疫后，發(fā)現(xiàn)其排卵率得到了有效地提高，進一步說明了抑制素是影響山羊排卵率的一個重要基因.

本實驗選取處于發(fā)情周期相同階段的藏山羊和金堂黑山羊為研究對象，克隆得到INHA、INHBA基因序列.藏山羊INHA基因編碼區(qū)和金堂黑山羊有7處堿基不同，導致了3處氨基酸的差異;INHBA基因編碼區(qū)有4處堿基不同，導致了1處氨基酸的差異.已有研究結果表明［26-28］，抑制素INHA基因和INHBA基因核苷酸的突變會影響母羊的產(chǎn)羔數(shù).藏山羊與金堂黑山羊INHA、INHBA氨基酸序列的差異是否會引起FSH分泌量的變化，進而使得山羊排卵數(shù)發(fā)生改變而影響山羊的繁殖性狀還有待進一步研究.藏山羊、金堂黑山羊的INHA基因和INHBA基因編碼區(qū)序列與綿羊、牛等其他物種的基因編碼區(qū)序列的同源性都較高，說明INHA和INHBA基因在各物種間的保守性均較高.利用MAGA6.0軟件構建INHA和INHBA基因的核苷酸系統(tǒng)發(fā)生樹，結果顯示，藏山羊和金堂黑山羊二者親緣關系最近，其次是綿羊、牛、野豬，各分支的置信度高，并且符合動物分類學結果，表明系統(tǒng)發(fā)生樹可信度較高.INHA、INHBA的mRNA分別在藏山羊和金堂黑山羊的卵巢和垂體中均有表達，但兩個品種各組織間mRNA表達量均無顯著性差異(P＞0.05)，說明山羊排卵數(shù)差異的主要原因并不是由INHA和INHBA兩個基因mRNA表達量的差異引起的.

4 結論

本試驗首次克隆出藏山羊、金堂黑山羊INHA和INHBA基因，兩個山羊品種的INHA基因編碼區(qū)序列有7處堿基不同，導致3處氨基酸的差異;INHBA基因編碼區(qū)序列有4處堿基不同，導致1處氨基酸的差異.INHA和INHBA基因在兩個山羊品種的卵巢和垂體中均有表達，但品種間mRNA表達量無顯著性差異.

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cDNAcloning，sequence analysis and tissue expression of INHA and INHBA genes in goats

ZHENG Jie，LIU Shuang，LUOBin，ZI Xiang-dong
(School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

Ovary and pituitary samples were collected from five non-prolific Tibetan goats and five prolific Jintang black goats in estrus，to clone and analyze sequences ofINHAandINHBAcDNA by RT-PCR，and their mRNA expression levels were determined by real-time PCR.The result showed that the coding region of Tibetan goat and Jintang black goatINHAgene were 1083bp long，encoding 360 amino acids.There were seven base changes between the two breeds，leading to three differences in amino acid.The coding region of Tibetan goat and Jintang black goatINHBAgene were 1278bp long，encoding 425 amino acids.There were four base changes between the two breeds，leading to one amino acid difference.The homologies of coding region ofINHAgene between Tibetan goat，Jintang black goat，Ovis aries，Bos taurus，Sus scrofa，Mus musculus，Rattus norvegicus，Homo sapiens were 99.4% ，98.9% ，95.8% ，88.6% ，81.0% ，79.5%and 84.8% ，respectively.The homologies of coding region ofINHBAgene between Tibetan goat，Jintang black goat，Ovis aries，Bos taurus，Sus scrofa，Mus musculus，Rattus norvegicus，Homo sapiens were 99.7%，99.4%，98.1%，91.7%，88.0%，88.5%and 91.2%，respectively.TheINHAandINHBAmRNA were expressed in ovary and pituitary in both goat breeds，but there was no significant difference between the two breeds(P ＞0.05).The result showed that bothINHAandINHBAgenes were conservative in animal evolution，and their effect on prolificacy in goats needs to be further studied.

Tibetan goat;Jintang black goat;INHA;INHBA;prolificacy

S814;S827

A

2095-4271(2015)06-0672-06

10.11920/xnmdzk.2015.06.003

2015-08-15

字向東(1963-)，男，白族，云南云龍人，教授，研究方向:動物遺傳育種與繁殖，E-mail:zixd@sina.com

四川省應用基礎項目(2013JY0043)

(責任編輯:李建忠，付強，張陽，羅敏;英文編輯:周序林，鄭玉才)