耿亞亞，王妍力，李小旭，郝葆青

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

沼澤紅假單胞菌對小鼠免疫功能影響的試驗研究

耿亞亞，王妍力，李小旭，郝葆青

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

為探討沼澤紅假單胞菌對動物免疫功能的影響，采用不同菌液濃度的沼澤紅假單胞菌飼喂小鼠，檢測小鼠免疫器官(脾臟和胸腺)實質(zhì)重量、巨噬細(xì)胞吞噬能力、外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率以及腸黏膜SIgA等指標(biāo)，分析沼澤紅假單胞菌對試驗小鼠免疫功能的影響.結(jié)果顯示，飼喂沼澤紅假單胞菌可促進(jìn)小鼠的體重增長，脾臟和胸腺的重量增加(P＜0.05);促進(jìn)機(jī)體巨噬細(xì)胞吞噬率、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率以及腸黏膜SIgA的變化(P＜0.05).結(jié)論:采用沼澤紅假單胞菌飼喂小鼠可提高其機(jī)體的免疫能力.

沼澤紅假單胞菌;免疫器官;巨噬細(xì)胞吞噬率;淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率;SIgA

沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是應(yīng)用最為廣泛的一種光合細(xì)菌，也是一類最早被認(rèn)定為飼料級添加劑的益生菌，其菌體營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高達(dá)65%，是一種理想的飼料蛋白［1］.同時，沼澤紅假單胞菌也含有種類豐富的生物活性物質(zhì)，包括葉酸、輔酶Q、類胡蘿卜素和大量B族維生素，它們可對動物腸道內(nèi)繁殖的正常菌群起到促進(jìn)或平衡的作用［2］.目前，有觀點認(rèn)為沼澤紅假單胞菌適應(yīng)性強(qiáng)，并產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)抑制有害菌的生長，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收［3］.并且，有報道認(rèn)為沼澤紅假單胞菌富含的各種活性因子及微量元素(比如硒)，能提高機(jī)體的生產(chǎn)性能和抗病能力［4-5］.但是對于沼澤紅假單胞菌促進(jìn)免疫功能的研究報道較少.試驗采用不同菌液濃度的沼澤紅假單胞菌飼喂小鼠，檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、腸黏膜SIgA以及免疫相關(guān)器官重量變化的觀察和檢測，分析沼澤紅假單胞菌對小鼠免疫功能的影響，為該光合菌制劑的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沼澤紅假單胞菌原濃度的菌液(活菌數(shù)為6×109個/mL)實驗室備用.恒河猴腎細(xì)胞系LLC-MK2，購自成都豪乙生物科技有限公司.

健康的4周齡雄性昆明小鼠(體重20.0±2.0 g)80只，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司.

植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA);PBS緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液);瑞氏染液;丙酮-甲醇固定液;瑞氏-姬姆薩混合染色液.

1.2 試驗方法

1.2.1 沼澤紅假單胞菌毒性試驗

將LLC-MK2細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，2.5×105個/孔.培養(yǎng)24 h后，用0.01 mol/L的無菌磷酸緩沖液(PBS)洗滌數(shù)次，除去沒有貼壁的細(xì)胞.然后將沼澤紅假單胞菌的原濃度菌液用細(xì)胞生長液10倍系列梯度稀釋至108，把不同濃度的稀釋液加入上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，培養(yǎng)72 h.對照孔內(nèi)僅加等量的生長培養(yǎng)液.采用MTT法測定各小孔的活細(xì)胞數(shù)，確定回歸方程，計算出半數(shù)抑制細(xì)胞存活指數(shù)(IC50)(抑制細(xì)胞數(shù)目一半時所需的藥物濃度).

1.2.2 沼澤紅假單胞菌對小鼠體重及免疫器官重量的影響

經(jīng)過3天適應(yīng)性飼養(yǎng)，將80只小鼠隨機(jī)分為四組(每組設(shè)兩個重復(fù)對照)，各組分別每天灌胃蒸餾水(對照組)，原濃度菌液(試驗組1)，2倍稀釋菌液(試驗組2)與4倍稀釋菌液(試驗組3)1 mL，飼喂期間小鼠自由采食(普通全價飼料)和飲水，隔日更換墊料，連續(xù)飼喂28天.各組小鼠每隔一日稱重并記錄.

1.2.3 沼澤紅假單胞菌對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響

試驗最后一次飼喂沼澤紅假單胞菌后1h，每組小鼠腹腔注射0.5%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL，輕柔小鼠腹部，分散雞紅細(xì)胞懸液.注射雞紅細(xì)胞30 min后，處死小鼠剖開腹腔，用注射器吸取腹腔液，滴加于潔凈的載玻片上，在墊有濕紗布的托盤內(nèi)于37℃孵育30 min，吹干，用丙酮-甲醇固定液(兩者比例為1:1)固定5 min，然后用瑞氏染液染色，在顯微鏡下觀察計數(shù)100個吞噬細(xì)胞，按文獻(xiàn)公式［6］計算吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)和被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù).試驗結(jié)束后，解剖取出脾臟、胸腺，稱重并記錄.

1.2.4 沼澤紅假單胞菌對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

選試驗組和對照組各10只小鼠，試驗組仍采用沼澤紅假單胞菌菌液連續(xù)飼喂8天，取飼喂3d、4d和6d分別進(jìn)行三次植物血凝素PHA(5 mg/kg)的肌肉注射.飼喂8d時，小鼠尾尖采血，推血涂片，用瑞氏-姬姆薩混合染色液染色30 s～1 min，用PBS緩沖液沖洗血片，顯微鏡觀察計數(shù)100個淋巴細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞、過渡型淋巴細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［7］計算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率.

1.2.5 腸黏膜SIgA含量測定

將上述試驗小鼠處死，取靠近回盲部的腸段1.5 cm，縱向剖開后用生理鹽水反復(fù)沖洗腸腔表面，刮取黏膜表面黏液，放入EP管中，加入0.5 mL 0.01 mol/L的PBS溶液混勻，10000 r/min離心15 min，取上清液，保存于-20℃待檢.采用伊萊瑞特生物公司試劑盒，然后用酶標(biāo)儀檢測.

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

最后采用EXCEL對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的處理，用spss 18.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，運用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 沼澤紅假單胞菌對LLC-MK2細(xì)胞無毒性

沼澤紅假單胞菌菌液的細(xì)胞毒性試驗結(jié)果顯示，試驗結(jié)果不能確定IC50(抑制細(xì)胞數(shù)目一半時所需的藥物濃度)，即使原濃度菌液(活菌數(shù)為6×109個/mL)10倍稀釋時，測試小孔的活細(xì)胞數(shù)也達(dá)到84%.試驗組與對照組的活細(xì)胞數(shù)無顯著差異(p＞0.05)，即沼澤紅假單胞菌的菌液對LLC-MK2細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性或毒性極低.因此，可推斷該沼澤紅假單胞菌菌液可用于動物飼喂，安全無副作用.

2.2 不同菌液濃度沼澤紅假單胞菌對小鼠體重變化的影響

相比對照組，各試驗組小鼠平均增重12.06±1.97 g，10.22 ±3.40 g，8.78 ±3.32 g，相對增重率分別達(dá)到137.82%、116.81%、100.34%(見表2-2).不同濃度的沼澤紅假單胞菌菌液對小鼠的增重情況也不同，試驗組1小鼠平均增重12.06 g，增重超過30%，高于其它試驗組，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，試驗組之間差異不顯著(P＞0.05).

以平均增重與相對增重率為縱坐標(biāo)、組為橫坐標(biāo)可得到不同濃度的沼澤紅假單胞菌對小鼠體重的影響圖，見圖1.由圖1可看出，隨著沼澤紅假單胞菌濃度的上升，各組小鼠體重也隨之上升且差異明顯.高濃度的沼澤紅假單胞菌菌液能有效增加體重，促進(jìn)小鼠的生長.與對照組比較，表明該組小鼠健康狀況良好.

表1 小鼠體重增值表Table 1 weight gain in mice

圖1 不同濃度的沼澤紅假單胞菌對小鼠體重的影響Fig.1 Effect of different concentrations of palustris on body weight of mice

2.3 沼澤紅假單胞菌對小鼠免疫器官、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

不同濃度的沼澤紅假單胞菌對脾臟和胸腺重量的影響程度也不同，試驗組1與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，并且與其它試驗組相比差異也顯著(P＜0.05)，試驗組2與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，與試驗組3相比，差異不顯著(P＞0.05)，試驗組3和對照組之間差異不顯著(P＞0.05)(如表2).表明所使用沼澤紅假單胞菌能夠促進(jìn)小鼠免疫器官的發(fā)育，濃度越高的菌液對小鼠免疫器官發(fā)育的促進(jìn)作用越顯著.結(jié)果還表明，相比對照組，各試驗組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均有增加，試驗組1與對照組相比，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率差異顯著(P＜0.05)，但與試驗組2相比，差異不顯著(P＞0.05).其它試驗組與對照組相比差異均顯著(P＜0.05)(如表2).表明沼澤紅假單胞菌作為益生菌有增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫的作用.

具有免疫功能的器官、組織、細(xì)胞和分子組成了機(jī)體的免疫系統(tǒng)［8］.淋巴細(xì)胞(Lymphocyte)是由淋巴器官產(chǎn)生的.它包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等亞類，分別介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫、體液免疫，并對腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞等具有殺傷作用［9］.淋巴細(xì)胞是反映特異性細(xì)胞免疫能力的重要指標(biāo)［10］.各試驗組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均有增加，表明沼澤紅假單胞菌對特異性細(xì)胞免疫有增強(qiáng)作用.

表2 不同濃度的沼澤紅假單胞菌對免疫器官、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響(每組10只小鼠)Table 2 Effect of different concentrations of palustris on immune organs and lymphocyte transformation rate

2.4 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

與對照組相比，各試驗組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)均有提高.試驗組1與對照組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)相比差異顯著(P＜0.05)，試驗組2與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，但試驗組3與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)(見表3)，表明沼澤紅假單胞菌能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)小鼠非特異性免疫功能.一定條件下，菌液濃度越高，提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力的作用越強(qiáng).

巨噬細(xì)胞既參與機(jī)體的特異性免疫，又在非特異性免疫過程中起著重要作用.巨噬細(xì)胞是機(jī)體防御功能的重要組成部分［11］.沼澤紅假單胞菌能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力.

表3 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Table 3 Effect of mouse peritoneal macrophages phagocytosis

2.5 小鼠腸黏膜SIgA含量測定結(jié)果

各試驗組SIgA含量均高于對照組，各試驗組的腸黏膜SIgA含量與對照組相比差異均顯著(P＜0.05)，而且試驗組之間的差異也顯著(P＜0.05)(如表4).表明沼澤紅假單胞菌可促進(jìn)腸黏膜SIgA的合成.SIgA抗體可中和病毒，是構(gòu)成腸道黏膜免疫的重要組成部分［12］.

表4 小鼠腸黏膜SIgA含量Table 4 Intestinal mucosal SIgA content

3 結(jié)論

沼澤紅假單胞菌可以促進(jìn)小鼠生長，促進(jìn)小鼠免疫器官的發(fā)育，菌液濃度越高的沼澤紅假單胞菌對小鼠免疫器官發(fā)育的促進(jìn)作用越顯著.沼澤紅假單胞菌可促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，有助于動物的生長，也可增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、SIgA的含量，從而增強(qiáng)小鼠的抗病能力.

本試驗結(jié)果表明，沼澤紅假單胞菌可以促進(jìn)或增強(qiáng)機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能.

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Effect of Rhodopseudomonas Palustris on the immune function of mice

GENG Ya-ya，WANG Yan-li，LI Xiao-xu，HAO Bao-qing
(School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

To investigate the influence ofRhodopseudomonas Palustrison the immune function of animals，the experimental mice were fed onRhodopseudomonas Palustriswith different concentrations.The immune organ(spleen and thymus)changes in weight，the phagocytic ability of macrophages，the conversion rate of peripheral blood lymphocytes and SIgA in the intestinal mucosa were detected in order to test the effect ofRhodopseudomonas Palustrison immune function in mice.The results showed that the mice fed onRhodopseudomonas Palustriscould significantly promote their weight gain，spleen and thymus weights(P ＜0.05)，and promote the body＇s macrophage phagocytosis rate，lymphocyte transformation rate and the content of intestinal mucosa SIgA(P＜0.05).The conclusion indicates the immune function of the mice fed by theRhodopseudomonas Palustriswas increased.

Rhodopseudomonas palustris;immune organ;macrophage phagocytosis rate;lymphocyte transformation rate;SIgA

Q939.9

A

2095-4271(2015)06-0678-04

10.11920/xnmdzk.2015.06.004

2015-07-20

郝葆青(1956－)，男，滿族，四川成都人，教授，博士.E-mail:1296714389@qq.com

西南民族大學(xué)研究生“創(chuàng)新型科研項目”(CX2014SZ89)

(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽，羅敏;英文編輯:周序林，鄭玉才)