張宏川，劉思洋，王 蕾，顧 健，李佳川，譚 睿

(1.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041;2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化葛根異黃酮提取工藝的研究

張宏川1，劉思洋1，王 蕾1，顧 健1，李佳川1，譚 睿2

(1.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041;2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

本文通過(guò)響應(yīng)面分析方法確定葛根異黃酮最佳提取條件.以葛根異黃酮提取率為指標(biāo)，利用響應(yīng)面分析法分別以超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比及提取時(shí)間等4因素為影響因子，考察各影響因子對(duì)葛根異黃酮提取率的影響.結(jié)果表明優(yōu)化提取條件后葛根異黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度為91.16%，超聲時(shí)間16.59 min，料液比15.42:1，提取時(shí)間1.35 h.理論提取率為1.125 mg/g，實(shí)際測(cè)得提取率為1.025 mg/g.Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法可以較好地對(duì)葛根異黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化.

葛根;葛根異黃酮;響應(yīng)面分析法

葛根(radix puerariae)為豆科植物野葛Pueraria Lobata(willd)Ohwi或葛粉P.Thomosonii Benth.葛根為常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，近幾年各方面對(duì)葛根中的多種有效成分研究比較活躍，其報(bào)道主要是對(duì)其藥理活性以及在動(dòng)物體內(nèi)代謝特點(diǎn)進(jìn)行探索.葛根藥材中所含的主要成分為異黃酮類(lèi)，如葛根素(Puerarin)、大豆黃酮(Daidzein)、大豆黃酮甙(Daidzin)、葛根素木糖甙(Puerarin-O-xyloside)、3’-甲氧基葛根素(3’-methoxy-puerarin)等［1］.葛根素的藥理作非常用廣泛，主要用于治療心腦血管疾病;并且具有多種藥理活性，其藥用價(jià)值具有廣闊的發(fā)展前景及重要的臨床應(yīng)用價(jià)值.目前利用響應(yīng)面法優(yōu)化葛根異黃酮提取工藝研究筆者未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)考察確定4因素影響因子分別為:超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比及提取時(shí)間，采用響應(yīng)面分析軟件中的Box-Behnken項(xiàng)設(shè)計(jì)建立有效數(shù)學(xué)空間模型［2-4］，以葛根異黃酮總提取得率作為唯一響應(yīng)值，通過(guò)正式實(shí)驗(yàn)對(duì)葛根異黃酮總提取率的最佳提取工藝條件進(jìn)行有效優(yōu)化.

1 材料、儀器與方法

1.1 材料

中藥購(gòu)自成都荷花池藥材市場(chǎng).本品經(jīng)西南民族大學(xué)民族藥物研究所顧健教授鑒定為藤本植物野葛(Lobed Kudzuvine Root.)的塊根，干燥根莖將其干燥、粉碎、過(guò)篩，存于干燥器中備用.

1.2 試劑及儀器

3’-羥基葛根素(批號(hào):1409098)、3’-甲氧基葛根素(批號(hào):1409112)、葛根素(批號(hào):1411121，HPLC＞98%，成都康邦生物科技有限公司)、大豆苷(批號(hào):13031404，HPLC≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司).乙腈、甲醇(色譜純，Sigma公司).儀器 Waters高效液相色譜(包括1525型二元高壓梯度泵系統(tǒng)、2695型二極管矩陣檢測(cè)器、717增強(qiáng)型自動(dòng)進(jìn)樣器、1500型柱溫控制系統(tǒng)，Empower色譜工作站)(美國(guó)Waters公司);電子分析天平［XP6，梅特勒-托利多(上海)有限公司］;

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

InertSustain C18色譜柱(4.6 ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為A甲醇-B 0.1%磷酸水，等度洗脫條件為A甲醇25%-B0.1%磷酸水75%.流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量10 μL.在上述色譜條件下，3’-羥基葛根素、3’-甲氧基葛根素、葛根素、大豆苷、分離度及拖尾因子均符合含量測(cè)定要求.樣品葛根總黃酮含量測(cè)定及對(duì)照品HPLC圖見(jiàn)圖1.

圖1 葛根總黃酮樣品(A)和對(duì)照品(B)的HPLC圖譜1.3’-羥基葛根素;2.3’-甲氧基葛根素;3.葛根素;4.大豆苷Fig.1 Pueraria total flavonoids sample(A)and reference(B)of the HPLC chromatogram1.3＇-hydroxy-Puerarin;2.3’-methoxy-puerarin;3.Puerarin;4.Daidzin

1.3.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱(chēng)取 3’-羥基葛根素 12 mg、3’-甲氧基葛根素20 mg、葛根素23 mg、大豆苷32 mg、將對(duì)照品置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為 0.12，0.20，0.23，0.32mg/mL 的各對(duì)照品儲(chǔ)備液.分別吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液3’-羥基葛根素2mL、3’-甲氧基葛根素2mL、葛根素2 mL、大豆苷2 mL、于10 mL量瓶中，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液.

1.3.3 樣品制備

取處理好葛根粉末2g，按照Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行29次試驗(yàn)，將得到葛根浸膏定容溶于50mL色譜甲醇，搖勻取1mL溶液定容于5mL容量瓶中制的樣品溶液.

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品3’-羥基葛根素0.10，0.30，1.00，1.50，2.50 mL;3’-甲氧基葛根素 0.30，0.40，0.50，0.60，0.70 mL;大豆苷 0.50，0.80，1.00，1.40，1.60，mL;置于 5 mL 容量瓶中，葛根素 0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL;置于1mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液各10 μL，按上1.3.1譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值(Y)與各異黃酮濃度(mg/mL)(X)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制.回歸方程分為:y=7E+07x+21071(R2=0.9995)y=2E+07x-2E+06(R2=0.9996)y=6E+07x–204667(R2=0.9998)y=2E+08x–886343(R2=0.9995).結(jié)果表明 3’-羥基葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、葛根素分別在0.0072～0.0600，0.6000～1.4000，0.0320 ～0.1024，0.0092 ～0.0460 mg/mL線(xiàn)性關(guān)系良好.

1.3.5 葛根異黃酮最佳提取條件確定

對(duì)單因素影響因子進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)考察，利用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，通過(guò)Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)團(tuán)建進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)出4因素3水平的響應(yīng)面正式試驗(yàn)，得到響應(yīng)面試驗(yàn)確切結(jié)果，獲得葛根異黃酮最佳提取條件.試驗(yàn)因素與實(shí)驗(yàn)水平安排見(jiàn)表1.

表1 葛根異黃酮提取水平因素Table 1 Kudzu isoflavone extract level factor

2 結(jié)果與分析

以超聲時(shí)間A、乙醇濃度B、料液比C和提取時(shí)間D為4因素影響因子，異黃酮總提取率為唯一響應(yīng)值(Y)，利用響應(yīng)面分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.試驗(yàn)數(shù)據(jù)及方案見(jiàn)表2.

表2 葛根異黃酮響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及方案法Table 2 Pueraria isoflavones response surface analysis methods of experimental data and programs

1-24號(hào)是析因?qū)嶒?yàn)，25-29號(hào)是中心實(shí)驗(yàn).對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可歸納出回歸方程:Y=-4.57799+0.070223A+0.061492B+2.01937C+0.22166D-(5.63E-05)AB-(6.15E-04)BD-(3.95E-03)BC+(1.05E-03)AD-0.0123AC+0.0481CD-(9.74E-04)A2-(3.19E-04)B2-1.03677C2-(6.91E-03)D2，各個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 葛根異黃酮各因素方差分析數(shù)據(jù)Table 3 Pueraria isoflavones each ANOVA data

由數(shù)據(jù)表3進(jìn)行分析可得出“Prob＞F”值＜0.01，可表明方程擬合度較為顯著，失擬項(xiàng)所對(duì)應(yīng)的F值為1.54，表明失擬項(xiàng)相相對(duì)于純誤差項(xiàng)不表示顯著.超聲時(shí)間(A)、乙醇濃度(B)的“Prob＞F”值小于0.01，可證明其影響因子對(duì)異黃酮得率影響非常明顯，對(duì)于葛根異黃酮響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)各因素影響大小可安排為:超聲時(shí)間＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比.二次方影響因子 A2、B2、C2的 Prob ＞F 值都 ＜0.0001，兩因素交互項(xiàng)BD、AB、CD、BC、AD、AC，其中 AC 項(xiàng)的 Prob＞F 值為0.0003較為顯著，由此表數(shù)據(jù)分析可以得出4個(gè)影響因子分別相對(duì)于葛根異黃酮的提取效率不是簡(jiǎn)單平面圖形所能表示出來(lái)的，如圖2.

如圖2所示響應(yīng)面圖形中的Y值對(duì)應(yīng)的各因素A、B、C、D構(gòu)成的一個(gè)三維空間的等高圖，可以直觀地在二維空間平面上反映各因素的兩兩交互作用以及對(duì)響應(yīng)值的影響.決定系數(shù)R2=0.9543，C.V.%=6.24，Adj R-Squared=0.9086說(shuō)明響應(yīng)面模型擬度較好合好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較小，在可控范圍之內(nèi)，因此可以利用此模型及條件對(duì)葛根異黃酮提取率進(jìn)行較好的優(yōu)化［5-6］.

通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出葛根異黃酮提取的最佳工藝條件:乙醇濃度為91.16%，超聲時(shí)間16.59 min，料液比15.42:1，提取時(shí)間1.35 h，葛根異黃酮理10 μL進(jìn)樣量論提取率為1.125 mg/g.考慮實(shí)際操作以及各方面客觀因素影響，將葛根異黃酮的提取條件在分析軟件所得出理論值基礎(chǔ)可以上進(jìn)行誤差內(nèi)的修正:液固比15:1乙醇濃度90%，，提取時(shí)間為1.4h，超聲時(shí)間17 min，在修正優(yōu)化后的條件下共進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)［7］，實(shí)際測(cè)得葛根異黃酮總得率結(jié)果見(jiàn)表4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果葛根異黃酮含量為與理論值差值較小.3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可表明利用響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)的方案所得到的有效數(shù)據(jù)有較好的可靠性［8-10］.

表4 葛根異黃酮驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 berberine alkaloids validation test results

3 討論

傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法一般采用正交設(shè)計(jì)，不能在進(jìn)行試驗(yàn)的整個(gè)區(qū)域上找到影響因素和響應(yīng)值之間的明確的函數(shù)表達(dá)式.響應(yīng)面分析法能有效避免正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值.通過(guò)數(shù)據(jù)分析及軟件所得回歸方程Y=-4.57799+0.070223A+0.061492B+2.01937C+0.22166D-(5.63E-05)AB-(6.15E-04)BD-(3.95E-03)BC+(1.05E-03)AD-0.0123AC+0.0481CD-(9.74E-04)A2-(3.19E-04)B2-1.03677C2-(6.91E-03)D2，能夠有效在空間體現(xiàn)出各個(gè)單因素對(duì)于提取葛根總黃酮含量影響大小及主次順序.各因素A、B、C、D構(gòu)成的一個(gè)三維空間的等高圖，可以直觀地在二維空間平面上反映各因素的兩兩交互作用以及對(duì)響應(yīng)值的影響.利用響應(yīng)曲面分析法中的Box-Behnken模型，對(duì)葛根總黃酮提取工藝最佳條件進(jìn)行確定，得出最優(yōu)影響因子數(shù)值［11-13］.修正后的工藝條件確定為:乙醇濃度90%，液固比15:1，超聲時(shí)間17 min，提取時(shí)間為1.4h，理論得率1.125 mg/g，實(shí)際測(cè)得值為1.025 mg/g，高于各文獻(xiàn)報(bào)道的葛根異黃酮提取含量.經(jīng)過(guò)優(yōu)化所得到的提取含量與相同條件下的平行實(shí)驗(yàn)理論提取含量相差甚小.由此可說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化所得到的葛根總黃酮最佳提取工藝條件技術(shù)是可靠的，并且可以為將來(lái)中試開(kāi)發(fā)提供有力數(shù)據(jù)基礎(chǔ)［14-16］.

圖2 4因素影響因子相互作用對(duì)應(yīng)響應(yīng)值的空間立體圖Fig.2 4-dimensional space corresponding to the interaction of factors affecting the response factor values figure

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Isoflavones extraction technology optimized by response surface methodology

ZHANG Hong-chuan1，LIU Si-yang1，Wang Lei1，GU Jian1，LI Jia-chuan1，TAN Rui2
(1.Institute of Ethnic Medicine，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.;2.School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，P.R.C.)

The article identified the optimum conditions for the extraction of isoflavones via response surface analysis.Based on the pueraria isoflavone extraction rate index，response surface analysis method was used to four factors including ultrasound time，ethanol concentration，solid-liquid ratio and extraction time，and to inspect each factor on the extraction rate of isoflavones.The results showed that the optimized extraction conditions of isoflavones were as follows:ethanol concentration was 91.16%，ultrasonic time 16.59，liquid ratio 15.42:1，extraction time 1.35 h;Theoretical extraction rate of 1.125 mg/g;The actual extraction rate measured reached 1.025 mg/g.Box-Behnken experimental design method can optimize the extraction technology of isoflavones.

pueraria;isoflavones;response surface methodology

R284

A

2095-4271(2015)06-0695-06

10.11920/xnmdzk.2015.06.007

2015-09-28

顧健(1967-)，男，漢族，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥及民族藥物開(kāi)發(fā)與研究，E-mail:gujiancd@163.com

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2013ZX09103-002-014);西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目(2015XWDS0703);西南民族大學(xué)研究生“創(chuàng)新型科研項(xiàng)目”(CX2015SZ036)

(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽(yáng)，羅敏;英文編輯:周序林，鄭玉才)