陳錦龍 饒朗毓 王華民 (海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199)

假絲酵母菌是一類寄居在人體各個部位的真菌，其中口腔是較為常見的寄居部位，對維持口腔中的微生態(tài)平衡起到一定的作用，屬于正常菌群。同時(shí)，假絲酵母菌也是臨床上較為常見的條件致病菌之一〔1〕。在眾多的假絲酵母菌中，白假絲酵母菌是致病性最強(qiáng)的一種，臨床上由其引起的假絲酵母菌病也較常見。近幾年，在臨床上一些免疫抑制劑、抗生素和激素廣泛使用;器官移植增多;各類介入性診療技術(shù)的開展以及獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)蔓延，在一定程度上提高了嚴(yán)重免疫缺陷患者的數(shù)量。這樣導(dǎo)致了條件致病性微生物的感染不斷增多。隨著免疫缺陷患者的增多，條件致病性真菌感染率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，口腔感染也不斷增加。在口腔感染中，假絲酵母菌感染率最高，其中又以白假絲酵母菌最常見，口腔假絲酵母菌的感染是AIDS患者最常見最先發(fā)生的繼發(fā)性感染之一。本文擬了解住院病人口腔假絲酵母菌的分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料 2009年11月20日開始，采集海南醫(yī)學(xué)院附院住院病人口腔拭子標(biāo)本199例。①YEPD液體培養(yǎng)基的制備 分別量取酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖(重量為4、8、8 g)放置500 ml燒瓶中，再量取蒸餾水400 ml，加入燒瓶，密封包裝，至高壓蒸汽滅菌器滅菌(115℃ 10 min)。取出后室溫放置至冷卻，用微量移液器加入氯霉素注射液，使青霉素的最終濃度為50μg/ml。用微量移液器1 ml分裝到凍存管中備用。②YEPD固體培養(yǎng)基的制備:分別量取酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖和瓊脂(重量為:4、8、8、6.5 g)放置500 ml燒瓶中，再量取蒸餾水400 ml，加入燒瓶，密封包裝，至高壓蒸汽滅菌器滅菌(115℃10 min)。取出后室溫放置至冷卻，50℃時(shí)用微量移液器加入氯霉素注射液，使青霉素的最終濃度為50μg/ml?；靹蚝髢A倒至直徑為7 cm的無菌平皿中，冷卻至室溫凝固，放置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察記錄是否合格，污染的棄掉，合格的保存?zhèn)溆?。③玉米粉培養(yǎng)基:量取玉米粉40 g溶于500 ml蒸餾水中，65℃水浴1 h，過濾，再量取Tween80 10 ml和瓊脂16 g加入，補(bǔ)充500 ml蒸餾水。至高壓蒸汽滅菌器滅菌(121℃15 min)，取出后室溫冷卻至50℃，倒入直徑為7 cm無菌平皿制成玉米粉培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆?。顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽生物技術(shù)研究所的CHROMagar假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基，按照產(chǎn)品說明書比例(4.77 g干粉溶于100 ml蒸餾水)配備成顯色培養(yǎng)基，用于初步鑒定假絲酵母菌。

1.2 采集方法 無菌操作采取住院病人的口腔拭子標(biāo)本，放到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中保存培養(yǎng)。

1.3 假絲酵母菌分離 在生物安全柜中，無菌操作將標(biāo)本接種于YEPD固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄。對疑似菌落進(jìn)行涂片革蘭染色、乳酸酚棉藍(lán)染色后鏡檢進(jìn)一步鑒定。

1.4 顯色培養(yǎng)基鑒定 按照使用說明書操作方法將初步鑒定的假絲酵母菌接種于顯色培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)48 h，觀察菌落情況及結(jié)果判定。若菌落為綠色則為白假絲酵母菌，藍(lán)色則為熱帶假絲酵母菌，紫色則為光滑假絲酵母菌，粉紅色則為克柔假絲酵母菌，白色則為其他假絲酵母菌。

1.5 芽管形成試驗(yàn) 在細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)上，滴加入滅活的兔血清(0.2 ml/孔)，取一定量的假絲酵母菌接種到兔血清中，置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)3 h，取出后制成壓滴片，觀察結(jié)果并記錄。

1.6 厚膜孢子形成試驗(yàn) 根據(jù)《中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)全書》中的方法〔2〕，將假絲酵母菌接種于玉米粉培養(yǎng)基上，至培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)3 d后，長出可見菌落，在菌落上加上蓋玻片，輕輕壓平，顯微鏡下觀察厚膜孢子和假菌絲的情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 總分離率 分離出假絲酵母菌菌株87株(43.72%)。實(shí)驗(yàn)室診斷鑒定假絲酵母菌菌種分布，白色假絲酵母菌的檢出率最高，顯著高于其他菌種總檢出率(35.63%，31/87)(χ2=14.37;P＜0.01)。見表1。

2.2 不同年齡段感染情況 ≥71歲患者檢出率最高，顯著高于其他年齡段平均檢出率(36.24%，54/149)(χ2=13.47;P＜0.01)。見表2。

表1 住院病人假絲酵母菌菌種分布及構(gòu)成比(%)

表2 住院病人假絲酵母菌的不同年齡段分布

2.3 不同科室感染情況 內(nèi)科患者的檢出率最高，顯著高于其他科室平均檢出率(36.67%，44/120)(χ2=6.12;P=0.01)。見表3。

表3 住院病人假絲酵母菌的不同科室分布

2.4 內(nèi)科各科室感染情況 呼吸內(nèi)科檢出率最高，高于其他內(nèi)科科室平均檢出率(51.02%，25/49)，但差異不顯著(χ2=0.60;P=0.44)。見表4。

表4 住院病人假絲酵母菌的內(nèi)科各科室分布

2.5 外科各科室感染情況 神經(jīng)外科檢出率最高，高于其他外科科室平均檢出率(26.79%，15/56)，但差異不顯著(χ2=1.53;P=0.22)。見表5。

2.6 男女感染情況 男性患者檢出率(43.43%，43例)略高于女性(44.0%，44 例)，差異不顯著(χ2=0.01;P=0.94)。

表5 住院病人假絲酵母菌的外科各科室分布

3 討論

伴隨人口老齡化，臨床嚴(yán)重疾病如腫瘤、慢性肺疾病、糖尿病、AIDS等發(fā)病率不斷上升，一些深部假絲酵母菌感染，比如肺部假絲酵母菌感染率也日益增多且趨于復(fù)雜多變，常為致死性終末感染。其特點(diǎn)有一快(病情變化快)、兩高(發(fā)病率、死亡率高)、三低(臨床、實(shí)驗(yàn)室診斷率和及時(shí)治療率均低)?？谇患俳z酵母菌的感染是AIDS患者最常見最先發(fā)生的繼發(fā)性感染之一。白色假絲酵母菌的檢出率最高，可能的原因是:①臨床上，引起假絲酵母菌病以白假絲酵母菌最常見。在各類假絲酵母菌中，白假絲酵母菌致病性又是最強(qiáng)的，引起人假絲酵母菌病中，相關(guān)的研究表明其致病菌主要是白假絲酵母菌。②白假絲酵母菌是常見的致病性真菌，可以引起人類的口腔炎和陰道炎等黏膜疾病。另外，它是無免疫應(yīng)答患者的主要致病性真菌，隨著化療、移植以及AIDS患者的不斷增多，念珠菌病已經(jīng)成為免疫力低下患者的常見繼發(fā)感染病，也嚴(yán)重威脅患者的生命安全。③白假絲酵母菌與都柏林假絲酵母菌生物學(xué)性狀上，表型特征非常相似〔3，4〕，而本研究只是初步鑒定，沒有將二者鑒定區(qū)分開，鑒定為白假絲酵母菌的標(biāo)本中是否混有都柏林假絲酵母菌還需進(jìn)一步區(qū)別。

本文發(fā)現(xiàn)≥71歲患者檢出率顯著高于其他年齡段，可能的原因是:隨著老年患者機(jī)體各組織器官的功能不斷減退，免疫功能不斷下降，抗感染能力有所降低，更容易發(fā)生真菌感染，各種嚴(yán)重免疫缺陷老年患者的數(shù)量顯著增加。同時(shí)，內(nèi)科患者的檢出率顯著高于其他科室，其中又以呼吸內(nèi)科檢出率最高。原因:①呼吸內(nèi)科老年患者較多，一些介入性診療技術(shù)也為真菌感染提供了有利的條件。②肺部疾病患者較多，其炎癥性損傷，更利于真菌的入侵感染，另外，治療上，長期聯(lián)合使用廣譜抗生素引起的菌群失調(diào)也可以誘發(fā)真菌的二重感染〔5〕。

1 廖萬清，吳紹熙.真菌病研究進(jìn)展〔M〕.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，1998:87-116.

2 李影林.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)全書〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1997:1996-7.

3 Kim JO，Garofalo L，Blecker-Shelly D，et al.Candida dubliniensis infections in a pediatric population:retrospective identification from clinical laboratory isolates of candida albicans〔J〕.JClin Microbiol，2003;41(7):3354-7.

4 王 燕，隋秀麗，宋秀麗.熱帶假絲酵母菌致敗血癥及膝關(guān)節(jié)化膿性感染1例〔J〕.中醫(yī)正骨，2009;21(10):72.

5 蔣景華，王宗欣.呼吸內(nèi)科白色假絲酵母菌的分布及藥物敏感性分析〔J〕.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009;19(17):2358.