單群達(dá) 黃珍珍 陳鵬龍 藍(lán)海鷹 靳春雷 陳莉莉 徐雪琴

[摘要] 目的 探討在產(chǎn)前篩查血清標(biāo)本離心前放置時間及溫度對游離人絨毛膜促性腺激素β亞基（free β-hcg）、甲胎蛋白（AFP）、游離雌三醇（uE3）測定結(jié)果的影響。 方法 額外收集產(chǎn)前篩查標(biāo)本全血6 mL，分裝至5支試管（水浴組加做一支用于對照），在室溫（23℃～25℃）或水浴箱（35℃～37℃）下分別放置0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h后離心分離血清，以室溫下0.5 h分離血清的標(biāo)本作為對照組，各組與對照組分別進(jìn)行比較分析。 結(jié)果 置室溫組樣本free β-hcg以約每小時0.9%的速率上升，AFP、uE3與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；水浴條件下free β-hcg以約每小時10.9%的速率迅速升高，AFP以每小時0.6%的速率上升，uE3則以每小時0.5%的速率降低。 結(jié)論 室溫條件下，2 h內(nèi)分離對結(jié)果影響較小，水浴條件對free β-hcg結(jié)果有嚴(yán)重影響，對其余兩項(xiàng)也存在影響。產(chǎn)篩標(biāo)本應(yīng)盡量在較低溫度下處理，建議不要對產(chǎn)前篩查標(biāo)本進(jìn)行37℃水浴處理。

[關(guān)鍵詞] 分析前變異；產(chǎn)前篩查；質(zhì)量控制；溫度

[中圖分類號] R715.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）30-0011-04

Effect of temperature and the duration on second-trimester serum markers

SHAN Qunda1 HUANG Zhenzhen1 CHEN Penglong1 LAN Haiying1 JIN Chunlei1 CHEN Lili1 XU Xueqin2

1.Prenatal Diagnosis Center， Lishui Maternity and Child Health Care Hospital， Lishui 323000， China； 2.Central Laboratory， the Central Hospital of Wenzhou City， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To examine the effect of the duration of storage of whole blood at different controlled temperatures on the concentrations of serum free-β-human chorionic gonadotropin （f-βhCG）、Alpha fetoprotein（AFP） and unconsecrated estriol（uE3）. Methods We additionally collected 6 mL of whole blood of prenatal screeningspecimen， respectively put into 5 vacuum tubes（The water bath group should make an additional piece for comparison）， placed at room temperature （23℃-25℃） or in the water bath box （35℃-37℃） for 0.5 h， 2 h， 4 h， 6 h， 8 h， after that， made a centrifugal separation to separate the blood serum， taken the specimen of blood serum separated atroom temperature for 0.5 h as the control group， and respectively compared and analyzed each group with the control group. Results In the room temperature group， f-βhCG had a rate of 0.9% per hour increasing. No significant difference was found in AFP and uE3（P>0.05）. In the 37℃ group， f-βhCG had a rate of 10.9% per hour increasing rapidly. AFP had a rate of 0.6% per hour increasing， and uE3 had a rate of 0.5% per hour decreasing. Conclusion Under the condition of room temperature， to separate in 2 hours has a less influence on the result， and the water bath condition has a serious effect on the results of free β-hcg and the other two items. The prenatal screening specimen should be processed at a lower temperature as far as possible， and it is not suggested to make a water bath treatment of 37℃ for the prenatal screening specimen.

[Key words] Preanalytical variation； Prenatal screening； Quality control； Temperature

產(chǎn)前篩查室通過定量測定孕婦血液中與妊娠有關(guān)的生化指標(biāo)，對胎兒患有先天異常的風(fēng)險進(jìn)行篩查評估。國內(nèi)目前采用的中孕期篩查方案為二聯(lián)法或三聯(lián)法。其原理為測定母體血清free β-hcg、AFP、uE3（只在三聯(lián)法中測定）的值，結(jié)合孕周、年齡、體重等因素，運(yùn)用風(fēng)險評估軟件對胎兒21三體、18三體及神經(jīng)管畸形的風(fēng)險進(jìn)行評估。母體血清測定結(jié)果直接影響到風(fēng)險的評估，而其結(jié)果的可靠性很大部分來自于分析前。目前產(chǎn)篩中心的標(biāo)本很大一部分來自于其下面的采血點(diǎn)，該部分標(biāo)本的質(zhì)量參差不齊，存在較多問題。雖然已有明確的規(guī)定用于保證分析前的標(biāo)本質(zhì)量[1]，但對標(biāo)本質(zhì)量的評價迫切需要一種有效而易普及的方法。英國國家篩查委員會于2007年啟動的DQASS質(zhì)評及保證計(jì)劃，通過周期性監(jiān)測所有產(chǎn)篩實(shí)驗(yàn)室的中位數(shù)倍數(shù)（MoM）中位數(shù)（mMoM）的值及風(fēng)險評估，來評價各實(shí)驗(yàn)室的篩查質(zhì)量及效率，找出實(shí)驗(yàn)室可能存在的誤差因素，提高篩查質(zhì)量，取得了良好的效果。在國內(nèi)，已有類似方案的提出，通過定期對mMoM值進(jìn)行監(jiān)測分析，找出造成mMoM異常波動和偏倚的因素，對中位數(shù)進(jìn)行合理的調(diào)整和修正[2]，筆者認(rèn)為這是目前較好的一種方法。影響mMoM值發(fā)生異常偏移的原因較多，本文著眼于標(biāo)本檢測的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性方面的研究。目前已有篩查標(biāo)本測定結(jié)果受離心前放置時間[3，4]、保存溫度[5]、運(yùn)輸[6]以及季節(jié)[7]等諸多因素的影響的報道，但均較少涉及明確的趨勢性變化關(guān)系的探討。總結(jié)后可以發(fā)現(xiàn)，這些文獻(xiàn)中的影響因素均涉及到溫度與標(biāo)本放置時間，也即本文所要討論的問題，其研究意義在于明確把握各項(xiàng)指標(biāo)的變化規(guī)律，以利于找出造成mMoM異常偏移的因素，為大批量臨床標(biāo)本質(zhì)量的評估提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年3月～2014年4月來本院進(jìn)行產(chǎn)前篩查的孕婦60例，孕周15～20周。平均年齡（27.9±4.2）歲，平均體重為（54.3±6.1）kg。告知孕婦本實(shí)驗(yàn)室在保證其原本申請項(xiàng)目的準(zhǔn)確及可靠的前提下，需要其對血液進(jìn)行分裝，并進(jìn)行額外的測試。

1.2 儀器與試劑

采用Perkin Elmer 1235自動時間分辨熒光免疫分析儀進(jìn)行測定，free β-hcg、AFP、uE3試劑均為WallacOy生產(chǎn)原裝配套試劑。測定前3個月室內(nèi)質(zhì)控均在控。

1.3 方法

靜脈采血完成后，立即收集來自生化、發(fā)光、免疫等無抗凝劑、無促凝劑管全血共60例，分裝于5根與產(chǎn)前篩查血清學(xué)試驗(yàn)相同的分離膠管內(nèi)（水浴組加做一支用于對照）。所有血液收集均在滿足生化、發(fā)光等項(xiàng)目測定及復(fù)查需要的前提下進(jìn)行，并不給孕婦帶來額外負(fù)擔(dān)。將同一孕婦血清分裝后的5根試管放置于室溫（30例）或37℃水浴溫度下（30例），0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h后離心，水浴組第6管血樣置室溫下0.5 h后離心用于對照，收集血清后編號密封保存于-20℃冰箱待檢。為了降低多天的收集過程中室溫波動對結(jié)果造成的影響，應(yīng)盡量減少收集標(biāo)本的天數(shù)。本實(shí)驗(yàn)實(shí)際收集天數(shù)為6 d，當(dāng)天10時室內(nèi)氣溫分別為：23.5℃、24.3℃、23.7℃、24.2℃、25.3℃、24.8℃。為了增加各組之間的可比性，盡量減少不同天次測量帶來的系統(tǒng)誤差，本文采用60例血清標(biāo)本在同一天同一批次內(nèi)完成測定的方案。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 37℃下進(jìn)行分析 觀察組，一名孕婦共有6管理論上初始值為相同的標(biāo)本，第6管血樣置室溫下0.5 h后離心保存，做為對照。其余5管在37℃水浴下經(jīng)0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h后分別離心，觀察free β-hcg、AFP、uE3的結(jié)果隨著分離時間的延遲所發(fā)生的變化。

1.4.2 室溫下進(jìn)行分析 觀察組，一名孕婦共有5管理論上初始值為相同的標(biāo)本，經(jīng)0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h后分別離心，檢測其free β-hcg、AFP、uE3的結(jié)果，以0.5 h離心分離的管為對照組，觀察其余各組結(jié)果的變化規(guī)律。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.5.1 37℃水浴條件下的實(shí)驗(yàn) 對6組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素重復(fù)測量方差分析，在整體比較有意義的前提下，以額外設(shè)立的室溫下0.5 h分離的標(biāo)本為對照組，0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h分離的標(biāo)本分別與對照組進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，調(diào)整顯著性水平為：α=0.05/5=0.01。

1.5.2 25℃室溫條件下的實(shí)驗(yàn) 對5組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素重復(fù)測量方差分析，在整體比較有意義的前提下，以0.5 h分離的標(biāo)本為對照組，2 h、4 h、6 h、8 h分離的標(biāo)本分別與對照組進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，調(diào)整顯著性水平為：α=0.05/4=0.013。

1.5.3 線性回歸分析 計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組的平均相對差值[8]，并且以該值為縱坐標(biāo)、以時間（h）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行一元一次線性回歸，以更直觀地描述濃度的趨向性變化。相對差值計(jì)算公式為：（實(shí)驗(yàn)組-對照組）/對照組，平均相對差值即相對差值累加后的均值。應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 水?。?7℃）下放置時間對AFP、free β-hcg、uE3的影響

37℃水浴條件下，uE3表現(xiàn)為下降趨勢，配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，2 h、4 h、6 h、8 h組與對照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AFP表現(xiàn)為上升趨勢，配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示2 h、4 h、6 h、8 h組與對照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。free β-hcg的均值表現(xiàn)為迅速的上升趨勢，配對t檢驗(yàn)示其0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h組與對照組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。平均相對差值分別為2.83%、23.02%、45.41%、61.77%、87.05%。將平均相對差值（y）與時間（x）進(jìn)行一元一次線性回歸，得出時間與free β-hcg的平均相對差值的回歸方程為y=-0.015+0.109x（R2=0.998），表明free β-hcg的含量隨著放置時間呈直線上升，其他回歸方程及其相關(guān)系數(shù)見表2。

2.2 室溫（23℃～25℃）下放置時間對AFP、free β-hcg、uE3的影響

室溫（23℃～25℃）條件下，單因素重復(fù)測量方差分析顯示AFP、uE3各組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。free β-hcg隨著放置時間的增加呈緩慢上升趨勢，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示4 h、6 h、8 h組與對照組差異具高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），平均相對差值分別為1.81%、3.69%、4.73%、7.72%。見表2。將平均相對差值（y）與時間（x）進(jìn)行一元一次線性回歸，得出時間與free β-hcg平均相對差值的回歸方程為y=-0.017+0.009x（R2=0.962），其他回歸方程及其相關(guān)系數(shù)見表3。

表2 室溫（23～25℃）下放置時間對AFP、free β-hcg、uE3的影響（x±s）

注：組內(nèi)比較以室溫0.5 h分離標(biāo)本為對照組，其他4個時間點(diǎn)分別與之進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，調(diào)整顯著性水平α=0.05/4=0.013，帶*表示其有顯著性差異

3 討論

hCG是由胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，有α和β亞基組成，在體內(nèi)主要以完整的形式存在，free β-hcg占總hCG的1%左右[8，9]。在室溫或水浴下放置時間的延長，hCG會分解為游離hCG，導(dǎo)致free β-hcg的測定結(jié)果升高[3]。本文進(jìn)一步計(jì)算了升高的相對差值，并進(jìn)行了線性回歸分析，根據(jù)斜率可知，37℃下free β-hcg以每小時10.9%的速率升高，大大地強(qiáng)于室溫條件下每小時0.9%的上升速率。一般認(rèn)為AFP為相對穩(wěn)定的蛋白類物質(zhì)，其結(jié)果不隨放置時間的延長而發(fā)生顯著性的變化[4，10，11]。本實(shí)驗(yàn)中AFP在室溫下未發(fā)現(xiàn)趨向性變化，在37℃下其以約每小時0.6%的趨勢上升，主要考慮為標(biāo)本放置在相對高溫的37℃環(huán)境中，水分揮發(fā)速率較大，標(biāo)本相對濃縮導(dǎo)致的結(jié)果。AFP線性回歸方程相關(guān)系數(shù)稍低（R2=0.936），可能是由于其相對差值較小，各種隨機(jī)誤差造成的影響較大引起。目前有觀點(diǎn)認(rèn)為uE3在全血狀態(tài)下不穩(wěn)定，容易分解[12]，也有觀點(diǎn)認(rèn)為全血中的uE3在4℃下保存結(jié)果穩(wěn)定[13]。本文中uE3在室溫下未發(fā)現(xiàn)趨向性變化，該結(jié)果與Brown LF[14]等得出的結(jié)果較一致，該篇中得出的一個結(jié)果為22℃條件下uE3在全血或血清中放置1周，其結(jié)果均穩(wěn)定。uE3在37℃水浴下表現(xiàn)為每小時約0.5%的下降趨勢。uE3的下降提示其在高溫下更不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解。如果將標(biāo)本水分的揮發(fā)因素考慮在內(nèi)，uE3的下降速率因比本文中所報道的數(shù)值更大一點(diǎn)。由于uE3的cv值較其他兩項(xiàng)檢測高，并且其下降比例較小，導(dǎo)致回歸方程相關(guān)系數(shù)較低（R2=0.777）。需要指出的是，本文中的室溫組只代表了平均氣溫23℃左右時的情況，實(shí)際工作中，不同實(shí)驗(yàn)室以及季節(jié)的變化，對篩查結(jié)果的影響程度均會有差別。

中孕期唐氏妊娠母血清中free β-hcg均呈持續(xù)上升趨勢，MoM值為正常孕婦的2.2～2.5倍；uE3在唐氏妊娠母體的表現(xiàn)為較正常水平降低，異常一般為<0.7 mom；APF在單獨(dú)使用以0.5MoM為標(biāo)準(zhǔn)，檢出率為20%，假陽性率5%[9]。水浴導(dǎo)致free β-hcg的濃度迅速升高，同時也影響AFP及uE3的穩(wěn)定性，這些變化均將導(dǎo)致假陽性結(jié)果的增多。這意味著需進(jìn)行更多不必要的羊膜腔穿刺，帶來更多的胎兒損失（羊膜腔穿刺流產(chǎn)率約0.5%）。因此，產(chǎn)篩標(biāo)本應(yīng)在較低的室溫下盡快分離，并及時保持于4℃冰箱，以盡量減少假陽性率的升高。

已有研究表明，篩查機(jī)構(gòu)本部采血標(biāo)本和采血點(diǎn)送檢標(biāo)本所測的AFP及free β-hcg的Median MOM不同，采血點(diǎn)標(biāo)本free β-hcg的正偏倚尤為明顯[15]。由于目前缺乏對標(biāo)本質(zhì)量的評估方法，只有高風(fēng)險率發(fā)生較大升高的采血點(diǎn)其標(biāo)本質(zhì)量才會引起產(chǎn)篩中心的注意。筆者所在單位下某一采血點(diǎn)，在7、8、9三個月的產(chǎn)前篩查高風(fēng)險率明顯上升，超過8%，經(jīng)聯(lián)系后得知，其產(chǎn)篩標(biāo)本分離時間為早上或者下午下班前30 min左右。而另一采血點(diǎn)，其12、1、2月份的產(chǎn)前篩查高風(fēng)險率有明顯上升，超過8%，經(jīng)聯(lián)系后得知，其實(shí)驗(yàn)室人員在冬天會將標(biāo)本置于37℃水浴箱內(nèi)，離心時間為下班前30 min。經(jīng)過與實(shí)驗(yàn)人員的交流與培訓(xùn)，加強(qiáng)標(biāo)本分離時間的管控，使用采血后室溫2 h內(nèi)分離并保存于4℃冰箱，上述采血點(diǎn)的高風(fēng)險率均得到有效控制。多數(shù)情況下，下屬采血點(diǎn)對標(biāo)本管理的不規(guī)范，所造成的是中風(fēng)險區(qū)域（灰區(qū)）數(shù)量的顯著增多，限于篇幅，在此不做進(jìn)一步討論。標(biāo)本的規(guī)范管理，是產(chǎn)前篩查質(zhì)控的重要環(huán)節(jié)，本文所得出的標(biāo)本采集及處理環(huán)節(jié)對結(jié)果造成的影響，可以進(jìn)一步明確溫度與放置時間對結(jié)果的影響，有利于找出影響標(biāo)本質(zhì)量的環(huán)節(jié)，為產(chǎn)篩標(biāo)本質(zhì)量評估方法的研究提供參考。

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（收稿日期：2014-12-18）