劉仁儀，羅新建

●博士（生）論壇 Doctor Forum

長期自主轉(zhuǎn)輪跑運(yùn)動對小鼠脾淋巴細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)，IL-2分泌及鈣調(diào)基因表達(dá)的影響

劉仁儀，羅新建

目的:通過構(gòu)建動物模型，研究運(yùn)動對淋巴細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)、IL-2分泌及鈣調(diào)基因表達(dá)影響，以探討長期適量強(qiáng)度運(yùn)動調(diào)控免疫機(jī)能的分子機(jī)制。方法:相互匹配雄性小白鼠隨機(jī)被分成控制組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組執(zhí)行長期自主轉(zhuǎn)輪跑運(yùn)動6個月，淋巴細(xì)胞分離自小鼠脾臟，胞內(nèi)鈣離子濃度通過熒光穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)分析系統(tǒng)測量熒光探針負(fù)載細(xì)胞懸液而確定，ELISA法檢測Con A體外刺激對淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平的影響，實(shí)時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞相關(guān)鈣調(diào)基因表達(dá)。結(jié)果:不管在含鈣緩沖液還是在不含鈣PBS溶液中，實(shí)驗(yàn)組OKT-3誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化幅度顯著高于控制組（P＜0.05，n=5）；實(shí)驗(yàn)組Con A體外刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞IL-2分泌水平顯著高于控制組（P＜0.05，n=6）；實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)基因STIM1和ORAI1核酸表達(dá)水平顯著低于控制組（P＜0.05，n=5）。結(jié)論:長期自主轉(zhuǎn)輪跑運(yùn)動可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感性，提高體外刺激誘發(fā)淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平，推測胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控基因表達(dá)下調(diào)可能是一種負(fù)反饋機(jī)制，以防止運(yùn)動誘發(fā)的胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，當(dāng)然這仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)深入研究運(yùn)動的調(diào)控機(jī)理。

自主轉(zhuǎn)輪跑；淋巴細(xì)胞；鈣穩(wěn)態(tài)；IL-2；鈣調(diào)基因

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本研究對象為白色雄性CD1瑞士小鼠，實(shí)驗(yàn)分組前鼠齡12周，體重（27.0±2.80）g。動物飼養(yǎng)房光照周期被控制為12 h/12 h明暗循環(huán)（07:00亮燈），小鼠被飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)籠內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)條件下，飲食任意可用，室溫（21±1）°C，實(shí)驗(yàn)動物使用獲得相關(guān)的動物管理及使用委員會的批準(zhǔn)。參照C.P.AVULA等[7]描述構(gòu)建長期自主轉(zhuǎn)輪跑運(yùn)動動物模型，相互匹配的雄性小白鼠隨機(jī)被分成控制組（CG）和自主跑輪運(yùn)動組（EG），運(yùn)動組小鼠采取一籠一鼠的飼養(yǎng)方式。自主跑輪是由動物自發(fā)運(yùn)動驅(qū)動跑輪轉(zhuǎn)動的裝置，它由不受任何限制轉(zhuǎn)輪（直徑:11 mm）組件，籠體和轉(zhuǎn)動感應(yīng)器（磁計數(shù)器，Sigma 500）構(gòu)成。通過磁計數(shù)器自動記錄動物跑的圈數(shù)和總行程等信息，實(shí)驗(yàn)操作人員7天/次登記記錄數(shù)據(jù)，并將磁計數(shù)器重設(shè)回位，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)超過6個月。動物處死時間定在上午8:00~9:00，異氟醚麻醉情況下斷頸處死動物。統(tǒng)計顯示，運(yùn)動組小鼠每周平均自主轉(zhuǎn)輪跑距離為（53.39±4.847）km。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，運(yùn)動組成功構(gòu)建了長期自主轉(zhuǎn)輪跑動物模型。

1.2 淋巴細(xì)胞分離

密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，利用淋巴細(xì)胞分層液（Biocoll）作密度梯度離心，具體的操作流程如下:準(zhǔn)備1個90 mm培養(yǎng)皿，將2個細(xì)胞濾網(wǎng)（孔徑:100 μm）放置其中，且在培養(yǎng)皿中加1 mL PBS溶液；處死實(shí)驗(yàn)動物，從其體內(nèi)取出脾臟；將脾臟置人細(xì)胞濾網(wǎng)上，一次性注射器柱塞端輕輕地研磨脾臟；1 mL PBS溶液清洗濾網(wǎng)和培養(yǎng)皿；準(zhǔn)備一個15 mL錐形試管，在其中加3 mL分離液（密度:1.077 g/mL）；非常小心地將細(xì)胞懸液加到分離液上；2 000 rpm離心20 min；將淋巴細(xì)胞層移出分離液；加8 ml PBS溶液清洗細(xì)胞2次；1 500 rpm離心10 min；棄細(xì)胞上清液，重懸細(xì)胞人1 mL PBS溶液。整個過程在無菌條件下操作完成。胎盤蘭檢測細(xì)胞的活性在98%以上，流式細(xì)胞儀前向-側(cè)向散射模式確定淋巴細(xì)胞純度在99%以上。全自動血細(xì)胞分析儀計數(shù)淋巴細(xì)胞。

1.3 藥劑和溶液

Fura-2AM（Molecular Probes Inc.，Eugene，OR）溶解在二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），儲備液濃度為1 mM/mL，-80°C保存。洋地黃皂苷（Digitonin）購自Sigma-Aldrich公司（美國），乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（Ethylene glycol bis（β-aminoethyl）-ether N，N，N'，N'tetraacetic acid，EGTA），二甲基亞砜（DMSO）購自Carl Roth公司（德國），鼠單克隆抗體CD3（Muromonab-CD3，OKT3）（1mg/ml）購自Janssen-Cilag公司（德國），達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's Modification of eagle's Medium，DMEM），胎牛血清（Fetal Bovine serum，F(xiàn)BS）細(xì)胞培養(yǎng)公司PAA（奧地利）。

1.4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測

（1）細(xì)胞孵育。1 mL含9×106個淋巴細(xì)胞的含鈣緩沖液（緩沖液組成包括:140 mM氯化鈉，3 mM氯化鉀，0.4 mM磷酸氫二鈉，10 mM羥乙基哌嗪乙磺酸，5 mM葡萄糖，1 mM氯化鎂，0.8 mM氯化鈣，pH=7.4）與5 μL Fura-2AM（Fura-2AM稀釋在DMSO中，儲備濃度1 mM）在室溫下孵育30 min，過量染劑通過3次離心法（1 500 rpm×10 min）移除，然后將細(xì)胞重懸在不含鈣PBS溶液中，細(xì)胞在冰箱冷藏條件（4~8°C）下保存。（2）熒光掃描。通過應(yīng)用熒光穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)分析系統(tǒng)（Deltascan；PTI，加拿大）測定細(xì)胞懸液Fura-2熒光強(qiáng)度，測試系統(tǒng)激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫寬度均設(shè)為10 nm，測定溫度設(shè)為（37±1）°C，每次負(fù)載Fura-2/ AM的淋巴細(xì)胞懸液（包含2.7×106個細(xì)胞），加人到熒光比色杯中，激發(fā)光波長設(shè)為340~380 nm，發(fā)射光波長設(shè)為510 nm。雙波長交替掃描，比色皿和溶液等自體熒光在實(shí)驗(yàn)前檢測，將自動減除，在2 h內(nèi)完成熒光指示劑負(fù)載細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測量實(shí)驗(yàn)。（3）刺激檢測。為測定在含鈣緩沖液中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，在靜息狀態(tài)下掃描比色杯熒光信號100 s以后，使用OKT3（應(yīng)用濃度10 μg/ml）刺激細(xì)胞650 s。為測定在不含鈣緩沖液中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，在無鈣PBS溶液（加0.1 mM EGTA）中測量細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，在最初100 s測量以后，OKT3加人測試介質(zhì)中分析系統(tǒng)掃描比色杯的熒光250 s，然后將CaCl2溶液加人比色杯中（終濃度0.8 mM）系統(tǒng)掃描熒光350 s。（4）濃度計算。加破膜劑10 mM Digitonin，使Fura-2和Ca2+結(jié)合達(dá)飽和，測得F340/ F380為Rmax；加人高濃度Ca2+螯合劑EGTA（終濃度為5 mM，pH=8.5），以充分螯合Ca2+，使Fura-2游離，測得的F340/F380為Rmin。根據(jù)G.GRYNKIEWICZ等[8]方程式進(jìn)行計算:

式中:Kd為鈣離子特異性熒光探針，F(xiàn)ura-2與Ca2+反應(yīng)的解離常數(shù)，生理?xiàng)l件下，其值是220 nmol·L-1；R為各測定點(diǎn)F340/F380熒光強(qiáng)度比值；Rmax和Rmin分別為上述測定的最大和最小熒光比值；Fmin和Fmax分別代表Ca2+為零及飽和時，在380 nm激發(fā)光下測得的Fura-2熒光強(qiáng)度（F380）。

1.5 酶聯(lián)免疫法檢測

運(yùn)動組和控制組小鼠脾臟CD3+淋巴細(xì)胞在非刺激條件下或者Con A刺激條件下（應(yīng)用濃度:10 μg/mL）進(jìn)行培養(yǎng)，2 mL DMEM培養(yǎng)基（包括抗體100 μg/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和10%v/v胎牛血清FBS，包含2×106個淋巴細(xì)胞），在37°C條件下，5%CO2培養(yǎng)箱培育細(xì)胞72 h。流式細(xì)胞儀的前向和測向散射模式監(jiān)控淋巴細(xì)胞活性。應(yīng)用Abcam公司IL-2（Interleukin-2）小鼠ELISA試劑盒通過全自動酶標(biāo)儀檢測運(yùn)動組和控制組細(xì)胞在培養(yǎng)基中IL-2的表達(dá)量。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測

1.6.1 總RNA抽提 應(yīng)用試劑盒RNeasy Mini Kit（Qiagen），按照生產(chǎn)商提供的產(chǎn)品使用說明，抽提分離冰凍裂解的CD3+淋巴細(xì)胞總RNA。另外，可能的DNA污染通過RNA分離試劑盒提供的RNase-Free DNase Set消化移除。抽提的RNA被重新溶解于RNase free water，儲存-80°C冰箱，直至使用。分離的總RNA定量及其完整性通過微量分光光度計NanoDrop ND-1 000 UVVis spectrophotometer（Nano-Drop Technologies）進(jìn)行分析。

1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄 使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（the high-capacity cDNA reverse transcription kit，Applied Biosystems），據(jù)產(chǎn)品使用說明，以0.5~1 μg總RNA為模板，加0.8 μL（25×，100 mM each）dNTP mixtures，1 μL（50 U/μL）MultiScribe?Reverse Transcriptase，2 μL（10×）RT Random Primers，2 μL（10×）RT Buffer和無菌蒸餾水至20μL，合成第一鏈cDNA。

1.6.3 實(shí)時定量熒光PCR mRNA表達(dá)利用實(shí)時熒光定量PCR儀iCycler（Bio-Rad）通過高靈敏DNA熒光染料iQ SYBR Green Supermix進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為:1個循環(huán)95°C預(yù)變性3 min；42個循環(huán)95°C變性15 s；61°C退火30 s；72°C延伸30 s，自動采集熒光信號，繪制溶解曲線。所有的引物是跨內(nèi)含子設(shè)計的，檢測最佳的退火溫，各個引物序列小結(jié)見表1，樣本雙倍檢測。通過基因β-actin恒定的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化測試目標(biāo)基因cDNA水平，通過溶解曲線判斷基因表達(dá)的特異性。樣本擴(kuò)增通過循環(huán)閾值（Ct）表示，計算目標(biāo)基因的循環(huán)閾值（Cttarget）與看家基因（Ctβ-aCtin）循環(huán)閾值之間的差值（ΔCt），運(yùn)動組和控制組特定基因表達(dá)的變化使用如下公式計算:2-Δ（ΔCt），Δ（ΔCt）=（ΔCtexercise，target-ΔCtcontrol，target）或（ΔCtexerciseII，target-ΔCtexerciseI，target）。

1.7 統(tǒng)計分析

分別以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SD）表示各定量指標(biāo)的平均值和離散程度，采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，樣本均數(shù)比較采用成組設(shè)計多個樣本均數(shù)單因素方差分析，P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物列表Table1 List of primers for real time PCR

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)以含鈣緩沖液為測試介質(zhì)時，不同劑量OKT3誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度變化

在第100 s，加OKT3刺激比色杯中淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速增加（見圖1A）；以3個劑量5，10和20 μg/mL OKT3分別刺激淋巴細(xì)胞650 s后，在控制組，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別達(dá)到（103.1±26.6）nM，（104.4±15.3）nM和（135.1±17.2）nM，而在運(yùn)動組分別達(dá)到（166.3±32.6）nM，（181.1±34.5）nM和（196.1±32.4）nM（見圖1B）。相同劑量OKT3刺激作用下，運(yùn)動組和控制組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度沒有顯著差異（P>0.05，n=5）。與刺激前細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度比較，以上3個劑量OKT3引起淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增幅（加OKT3刺激后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度-刺激前細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度），控制組分別為（50.5±9.8）nM，（63.8±6.7）nM和（76.7±4.4）nM，運(yùn)動組分別為（75.3±13.8）nM，（80.9±15.5）nM和（92.8±5.3）nM。當(dāng)分別以5和10 μg/mL 2個劑量OKT3刺激細(xì)胞時，比較運(yùn)動組和控制組淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增幅沒有顯著差異（P>0.05，n=5），而當(dāng)以20 μg/mL OKT-3刺激淋巴細(xì)胞時，運(yùn)動組和控制組之間存在顯著差異（P<0.05，n=5）。

2.2 當(dāng)以無鈣PBS溶液為測試介質(zhì)時，OKT3誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度變化

在100 s時，在含有0.1 mmol/L EGTA無鈣PBS溶液中加人刺激劑OKT3（應(yīng)用濃度:10 μg/mL）時，淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增幅非常少（見圖1A和1B）。為了評估細(xì)胞外溶液Ca2+內(nèi)流對胞內(nèi)鈣離子濃度增加的貢獻(xiàn)度，在第350 s時，加人CaCl2溶液，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速增加，這意味著胞外大量Ca2+可通過胞膜涌人細(xì)胞內(nèi)。在控制組和運(yùn)動組，OKT3誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別達(dá)到（178.0±30.4）nM和（366.0±68.9）nM，2組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，n=5）（見圖2B）。在控制組和運(yùn)動組，OKT3誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增幅分別達(dá)到（150.3±24.8）nM和（340.7±66.5）nM，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，n=5）（見圖2C）。

圖1 在含鈣緩沖液中，OKT3誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化Figure1 The change of OKT3-induced Ca2+concentration in Ca2+buffer in lymphocytes of mouse spleens.

圖2 在無鈣緩沖液中，OKT3誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化Figure2 The change of OKT3-induced Ca2+concentration in Ca2+-free buffer in lymphocytes of mouse spleens.

2.3 在絲裂原Con A刺激作用下，淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞IL-2分泌量的變化

根據(jù)IL-2標(biāo)準(zhǔn)品濃度15.6，31.25，62.5，125和250 pg/mL分別對應(yīng)的OD值（吸光度）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3A）。R2接近1，表示Y=0.005X標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合效果非常好，可靠性非常高。Con A體外刺激對小鼠脾淋巴細(xì)胞，在運(yùn)動組與控制組比較均具有誘生IL-2分泌的作用，2組IL-2分泌水平分別為（265.4±49.16）pg/mL和（140.8±27.42）pg/mL，差異具有顯著性（P<0.05，n=6）（見圖3B）。

圖3 Con A體外刺激對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IL-2分泌的影響Figure3 The effect of Con A as a stimulant in vitro culture on the secretion of IL-2 in lymphocytes of mouse spleens

2.4 長期自主跑輪運(yùn)動對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CRAC通道表達(dá)的影響

應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR的相對定量法分析，與控制組相比較，在運(yùn)動組STIM1基因表達(dá)顯著下調(diào)（45.6%±8.4%）（P<0.01，n=5），同樣，ORAI基因表達(dá)顯著下調(diào)（42.6%±10.8%）（P<0.05，n=5）（見圖4）。

圖4 長期自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)控基因的影響Figure4 The effects of long duration willing wheel-running on expression of Ca2+homeostasis-regulated genes in lymphocytes of mouse spleens

3 討論與分析

細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度是胞內(nèi)鈣離子濃度上調(diào)、下調(diào)和緩沖機(jī)制三者平衡的結(jié)果。在靜息狀態(tài)下，胞外鈣離子濃度通常比胞內(nèi)鈣離子水平高10 000倍[9]，這種高濃度差的維持是由于胞膜對鈣離子的不通透性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對鈣離子的螯合作用，胞膜的排泄作用以及胞內(nèi)鈣離子綁定蛋白的緩沖效應(yīng)而造成的[10]，主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬態(tài)的構(gòu)件以下幾種。（1）細(xì)胞膜上的鈣離子通道，它們負(fù)責(zé)將胞外Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)空間，這類通道又分成4類。第1類，鈣池操縱鈣離子通道（Store-operated Ca2+channels）。它是一類由胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存鈣耗竭而激活的鈣離子內(nèi)流通道，如鈣釋放激活鈣通道（Calcium release-activated calcium channels，CRAC通道），它由胞膜Orai分子組成，并被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上STIM（Stormal interaction molecule）分子所激活，STIM分子能感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)鈣離子濃度變化，并激活Orai分子，最后開放CRAC通道，在免疫細(xì)胞中，由Orail和STIM1組成的CRAC通道是鈣離子內(nèi)流的主要途徑。第2類，電壓門控鈣離子通道（Voltage-gated Ca2+channels）。它是由于細(xì)胞膜的去極化引起鈣離子內(nèi)流。第3類，受體門控鈣離子通道（Receptoroperated Ca2+channels）。它是由配體/受體介導(dǎo)鈣離子的人胞作用，包括一些TRP（Transient receptor potential）家族成員，1，4，5-三磷酸肌醇受體（InsP3R），P2X受體等。第4類，牽張激活鈣離子通道，它是由一些物理參數(shù)影響鈣離子人胞作用的。（2）細(xì)胞膜上的鉀離子通道，包括電壓門控和鈣離激活鉀離子通道，這類通道提供鈣離子進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)空間的電驅(qū)動力。（3）細(xì)胞膜上非選擇性陽離子通道。（4）細(xì)胞內(nèi)鈣池上的鈣離子通道，包括三磷酸肌醇受體（InsP3Rs）和Ryanodine受體（RyRs），它們負(fù)責(zé)鈣池內(nèi)鈣離子的釋放。（5）細(xì)胞膜上鈉離子通道，包括TRPM4等。（6）內(nèi)質(zhì)網(wǎng) SERCA鈣泵（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase）和細(xì)胞膜PMCA鈣泵（plasma membrane Ca2+ATPase），它們能分別將鈣離子泵人胞內(nèi)鈣池和胞外空間。（7）細(xì)胞內(nèi)鈣池，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)，線粒體，溶酶體，高爾基體，細(xì)胞核等。（8）細(xì)胞內(nèi)Ca2+結(jié)合蛋白。

靜息時，淋巴細(xì)胞膜上鈣離子通道功能性關(guān)閉，但當(dāng)用激動劑有絲分裂原（如Con A）、抗CD3單克隆抗體（如OKT3）或毒胡蘿卜素（Thapsigargin）刺激時，它們將迅速開放。這些刺激劑引起的細(xì)胞反應(yīng)，首先是胞內(nèi)鈣離子釋放，沿電化學(xué)梯度跨膜從鈣通道流人接著跨膜鈣離子流驅(qū)動一個持續(xù)或者振動式胞內(nèi)鈣離子濃度增加。抗CD3單克隆抗體（OKT3）或有絲分裂原（Con A）通過綁定T淋巴細(xì)胞/CD3復(fù)合物或細(xì)胞表面大量的糖蛋白，激活相關(guān)的信號分子，生成二酯酰甘油（DAG）和肌醇1，4，5-三磷酸（InsP3）。這2個產(chǎn)物都可充當(dāng)?shù)诙攀?，InsP3可促進(jìn)胞內(nèi)鈣池釋放鈣離子和持續(xù)的跨膜鈣離子流。通過胞膜上鈣離子通道進(jìn)人胞內(nèi)的鈣離子流，是改變胞內(nèi)鈣離子瞬態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制。

已知，F(xiàn)ura-2AM是最常用的高效檢測胞內(nèi)鈣離子濃度的雙波長熒光探針之一，可靈敏地測試微摩爾級鈣離子濃度。高級熒光瞬態(tài)/穩(wěn)態(tài)測量系統(tǒng)具有測量可靠、靈敏度高、使用方便和配制靈活等優(yōu)點(diǎn)，在穩(wěn)態(tài)光譜測量中，它提供最高的微弱信號檢出能力，可對熒光物質(zhì)進(jìn)行定量分析。在本研究中，當(dāng)使用無鈣含有0.1 mM EGTA的PBS溶液作為測試介質(zhì)，測量淋巴細(xì)胞懸液Fura-2AM負(fù)載的熒光時，以O(shè)KT3作刺激劑，僅能觀察到一個微不足道的刺激劑誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子濃度增加現(xiàn)象（見圖2A和2B）。這可能意味著，在OKT3刺激作用下，胞內(nèi)鈣池釋放鈣離子進(jìn)人細(xì)胞質(zhì)，在胞內(nèi)鈣離子濃度增加過程中不占有絕對的比例，胞內(nèi)鈣離子濃度增加可能源于細(xì)胞外空間，持續(xù)的跨細(xì)胞膜鈣離子流是引起胞內(nèi)鈣離子濃度增加最主要的因素。因?yàn)?，?dāng)在測試介質(zhì)中加人鈣離子時，觀察到一個非常強(qiáng)的跨膜鈣離子流促使胞內(nèi)鈣離子濃度迅速增加（見圖2A和2B）。

在本研究中，參照相關(guān)的文獻(xiàn)，采取一籠一鼠的方式構(gòu)建長期自主轉(zhuǎn)輪跑動物模型，這有利于長期跟蹤記錄動物運(yùn)動參與的情況。這種一籠一鼠自主轉(zhuǎn)輪跑方式不會像動物長期應(yīng)激一樣產(chǎn)生消極的適應(yīng)[11-12]，籠體環(huán)境符合單個嚙齒動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。而有關(guān)長期運(yùn)動對激動劑誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣瞬態(tài)的影響，尚未查到相關(guān)的文獻(xiàn)，但可參照以前有關(guān)長期應(yīng)激刺激對激動劑誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣瞬態(tài)影響的報道。Y.P.CSERMEL[13]調(diào)查長期過度擁擠對植物凝血素刺激小鼠脾T淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子瞬態(tài)影響，研究顯示，T淋巴細(xì)胞不足的鈣離子代謝適應(yīng)可能是老年人在長期應(yīng)激中免疫反應(yīng)削弱的主因。D.M.SILBERMAN等[14]研究長期溫和的應(yīng)激刺激對有絲分裂原誘導(dǎo)T細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)途徑的影響，發(fā)現(xiàn)長期暴露在溫和應(yīng)激環(huán)境中的小鼠，其T淋巴細(xì)胞在有絲分裂原作用下導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增幅減少。Y.SEI等[15]報道長期的束縛應(yīng)激（2 h/天，持續(xù)21天），在第3天和第7天，導(dǎo)致一個顯著的絲裂原刺激的CD4+T淋巴細(xì)胞鈣離子濃度增幅抑制，但第21天則不然；CD8+T細(xì)胞不受長期應(yīng)激的影響；長期應(yīng)激（7天）對絲裂原誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)有一個適度的抑制效應(yīng)，此研究顯示，應(yīng)激對淋巴細(xì)胞鈣離子動員的抑制效應(yīng)可能是應(yīng)激致免疫抑制早期的反應(yīng)。綜上所述，長期的應(yīng)激刺激可導(dǎo)致激動劑誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子增幅的抑制效應(yīng)。而本研究顯示，長期自主運(yùn)動能導(dǎo)致OKT3誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)增強(qiáng)，這可能暗示長期自主運(yùn)動與其他長期應(yīng)激刺激對機(jī)體免疫功能的影響有著不同的生理機(jī)制。

胞內(nèi)鈣池操控的胞外鈣離子進(jìn)人，開始于細(xì)胞內(nèi)鈣池的耗竭，其激活不依賴于InsP3生成。根據(jù)實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)，從OKT3細(xì)胞膜表面受體結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)鈣池鈣離子釋放，繼而引起跨膜鈣離子流爆發(fā)，細(xì)胞鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子InsP3的作用，可能是在長期自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞鈣反應(yīng)增強(qiáng)的關(guān)鍵。增強(qiáng)的鈣信號敏感性可能是細(xì)胞內(nèi)鈣池釋放增加和跨膜鈣流增強(qiáng)的主原因之一，因?yàn)樵鰪?qiáng)的細(xì)胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)伴隨著低的鈣通道基因表達(dá)，可能意味著長期自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動可促使小鼠脾淋巴細(xì)胞鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感性增強(qiáng)。這可能是長期自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動誘導(dǎo)機(jī)體免疫適應(yīng)的結(jié)果。本研究顯示，長期自主運(yùn)動促進(jìn)體外細(xì)胞培養(yǎng)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2分泌的功能，這就可能意味著，長期自主運(yùn)動增強(qiáng)機(jī)體免疫細(xì)胞功能。在本文的實(shí)驗(yàn)中，RT-PCR技術(shù)檢測卻發(fā)現(xiàn)，長期自主運(yùn)動誘導(dǎo)小鼠脾CD3+淋巴細(xì)胞鈣通道基因表達(dá)下調(diào)。綜上所述，增強(qiáng)的淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣信號反應(yīng)卻伴隨著降低的鈣通道基因表達(dá)，而且促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-2的機(jī)能。據(jù)此推測，長期運(yùn)動誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞鈣通道基因表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞功能來說它可能是一種正向的效應(yīng)，這是不是可防止運(yùn)動誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣超載？因?yàn)椋醒芯勘砻?，過量的跨膜鈣流可能意味著胞內(nèi)鈣超載，而這可能導(dǎo)致細(xì)胞功能削弱甚至細(xì)胞凋亡[16]。先前有研究表明，鈣超載是細(xì)胞死亡最后共同的通路[17]。推測，為了維持淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，控制胞內(nèi)鈣離子在一個適度的水平，需要有一個負(fù)反饋機(jī)制平衡長期運(yùn)動誘導(dǎo)的漸增的細(xì)胞內(nèi)鈣信號反應(yīng)。負(fù)反饋是一種穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制，通過機(jī)體自我調(diào)控過程，胞膜鈣通道在調(diào)控跨膜鈣流過程中起重要作用，減少其表達(dá)，因而可能減少鈣信號反應(yīng)強(qiáng)度，使其回歸一個正常的范疇。但長期運(yùn)動通過何種機(jī)制誘導(dǎo)鈣調(diào)基因表達(dá)尚不知道，是否與神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)免疫機(jī)能的目標(biāo)，氧化應(yīng)激的作用，骨骼肌與免疫組織間的對話等因素有關(guān)。

5 小 結(jié)

本研究顯示，長期自主轉(zhuǎn)輪跑運(yùn)動促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感性，提高體外刺激誘發(fā)淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平，推測胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控基因表達(dá)下調(diào)可能是一種負(fù)反饋機(jī)制，以防止運(yùn)動誘發(fā)的胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，當(dāng)然這仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)深人研究運(yùn)動的調(diào)控機(jī)理。

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Effects of Long-duration Willing Running-on-wheels on Intracellular Ca2+Homeostasis，IL-2 Secretion and Ca2+-regulating Genes Expression of Lymphocytes in Mouse Spleens

LIU Renyi，LUO Xinjian
（Dept.of PE，China University of Geosciences（Wuhan），Wuhan 430074，China）

By using animal models，the purpose of this study is to examine the effect of long-duration willing wheel-running on intracellular Ca2+homeostasis，expression of Ca2+-regulating genes and mitogen-induced secretion of IL-2 in lymphocytes of mouse spleens and to explore the molecular mechanism that how the long-duration and regular physical activities regulates the immune function.The male mice were divided to the two groups，the experimental group and the control group at random.The mice in the experimental group performed long-duration willing wheel-running for 6 months. Lymphocytes were separated from mouse spleens.Intracellular Ca2+was decided by using a spectrometer to measure fluorescent probe-loaded lymphocytes suspension.The effect of Con A as a stimulant in vitro culture on the secretion of IL-2 in lymphocyte was determined by using ELISA. The expressions of Ca2+-regulating genes were decided by real-time PCR analysis.Either in Ca2+-containing buffer or in Ca2+-free PBS solution，OKT3-induced change of intracellular Ca2+concentration was significantly higher in the experimental group than in the control group（P＜0.05，n=5）. The secretion of IL-2 is higher in the experimental group than in the control group by using Con A as a stimulant in vitro culture（P＜0.05，n=6）. However，the expression of mRNA，such as，Ca2+-regulating genes，STIM1，ORAI1，were down-regulated，significantly in the experimental group（P＜0.05 or 0.01，n=5）.This research suggested that long-duration willing running on wheels promotes the sensibility of intracellular Ca2+signals，and IL-2 secretion of in lymphocytes of mouse spleens.And we speculate that down-regulation of the Ca2+regulating genes expression might serve as a reverse feedback mechanism to protect cells from the unbalanced intracellular Ca2+homeostasis.Certainly it needs further experiments to investigate the mechanism that physical activities regulate intracellular Ca2+homeostasis of lymphocytes.

willing running on wheels；lymphocytes；Ca2+homeostasis；IL-2；Ca2+-regulating genes

G 804.2

：A

：1005-0000（2015）06-520-06

2015-07-04；

2015-11-11；錄用日期：2015-11-12

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金“杰出人才培育基金”項(xiàng)目（項(xiàng)目編號:CGU150607）

劉仁儀（1977-），男，湖南耒陽人，博士，副教授，研究方向?yàn)檫\(yùn)動與免疫。

中國地質(zhì)大學(xué)（武漢）體育部，湖北武漢430074。機(jī)制，而淋巴細(xì)胞鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能成為運(yùn)動調(diào)控免疫機(jī)能研究的一個突破口，因?yàn)榧?xì)胞鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一重大的運(yùn)動醫(yī)學(xué)前沿的課題，細(xì)胞鈣信號網(wǎng)絡(luò)涉及到超過2萬種相關(guān)蛋白質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+是一種高效低廉，作用非常廣泛的陽離子，它是細(xì)胞內(nèi)重要的，普遍存在的第二信使物質(zhì)之一，是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的一個焦點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，即[Ca2+]i，其增減可成為眾多細(xì)胞生化反應(yīng)“啟”和“閉”的開關(guān)，它廣泛參與細(xì)胞功能反應(yīng)過程，如基因表達(dá)[1-2]、轉(zhuǎn)錄因子激活[3]、自由基代謝[4]、細(xì)胞增殖[5]和細(xì)胞分化[6]等。然而，據(jù)所掌握的文獻(xiàn)，目前尚無研究系統(tǒng)探討長期適宜強(qiáng)度運(yùn)動對機(jī)體淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)影響及其調(diào)控機(jī)理。文獻(xiàn)顯示:（1）脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，它含有大量的T淋巴細(xì)胞，鼠單克隆抗體CD3（Muromonab-CD3，OKT3）和刀豆球蛋白A（Concanavalin A，Con A）可引起淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化，它們常用作研究淋巴細(xì)胞功能便捷的藥物工具，ConA具有強(qiáng)力促淋巴細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，通過使用Con A來刺激淋巴細(xì)胞這一途徑，它也可用來評估淋巴細(xì)胞功能；（2）細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞分泌的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，是免疫系統(tǒng)重要的信息分子，IL-2是在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用的細(xì)胞因子之一，主要由活化T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，通過檢測IL-2分泌水平，可以反映機(jī)體的免疫功能高低，尤其是細(xì)胞免疫功能；（3）細(xì)胞膜上鈣離子通道調(diào)控胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，在免疫細(xì)胞，胞外Ca2+內(nèi)流主要由胞膜上CRAC（Ca2+release-activated Ca2+）通道完成，而它由胞膜Orai分子（包括3個亞型:Orai1，Orai2和Orai3，而Orai1是最重要的）組成，并被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上STIM（Stormal interaction molecule）分子（包括STIM1和STIM2 2個亞型，而STIM1是最重要的）所激活，STIM分子能感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)鈣離子濃度變化，并激活Orai分子，最后開放CRAC通道。因此，本研究試圖通過研究長期自主轉(zhuǎn)輪跑運(yùn)動對小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，相關(guān)的鈣調(diào)基因STIM1和Orai1表達(dá)，以及刀豆球蛋白A體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞IL-2分泌的影響，揭示長期自適宜強(qiáng)度運(yùn)動調(diào)控機(jī)體免疫功能可能的分子機(jī)制。

10.13297/j.cnki.issn1005-0000.2015.06.010

機(jī)體免疫系統(tǒng)執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能反應(yīng)過程，運(yùn)動是提高機(jī)體免疫功能的重要手段。一般來說，長期適宜強(qiáng)度的運(yùn)動促進(jìn)機(jī)體免疫功能，而過度負(fù)荷運(yùn)動則抑制（或削弱）免疫機(jī)能。國內(nèi)外有許多研究試圖闡明運(yùn)動影響機(jī)體免疫功能的分子