韋江彭海燕蘇翠云宋向群王惠臨寧瑞玲周韶璋

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院化療二科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

基礎(chǔ)研究

EM L4-ALK融合基因陽(yáng)性表達(dá)的人肺腺癌H 2228細(xì)胞對(duì)克唑替尼耐藥后BIM信號(hào)通路的影響

韋江1，2彭海燕1，2蘇翠云1宋向群1王惠臨1寧瑞玲1周韶璋1

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院化療二科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的 建立人肺腺癌H2228克唑替尼耐藥細(xì)胞株，探討克唑替尼（crizotinib）誘導(dǎo)EML4-ALK融合基因陽(yáng)性表達(dá)的人肺腺癌細(xì)胞H2228在BIM信號(hào)通路中的作用。方法 克唑替尼按50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、500 nmol/L、1 000 nmol/L的濃度逐步遞增法誘導(dǎo)人肺腺癌H2228細(xì)胞株獲得性耐藥；分別采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H2228和H2228/CR細(xì)胞在不同濃度克唑替尼作用后的IC50和細(xì)胞凋亡率；采用Western blot法檢測(cè)H2228和H2228/CR細(xì)胞在BIM信號(hào)通路關(guān)鍵分子ALK、p-ALK、ERK、p-ERK及BIM蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 成功誘導(dǎo)克唑替尼耐藥細(xì)胞株H2228/CR；MTT法檢測(cè)H2228/CR細(xì)胞和H2228細(xì)胞的IC50分別為3 418 nmol/L、335 nmol/L，H2228/CR細(xì)胞的耐藥指數(shù)為10.20，H2228/CR細(xì)胞在不同濃度克唑替尼作用下的增殖抑制率低于H2228細(xì)胞（P＜0.05）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞有促凋亡作用，且呈時(shí)間依賴性（P＜0.05），H2228/CR細(xì)胞的凋亡率明顯低于H2228細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05）；Western blot法檢測(cè)顯示H2228/CR細(xì)胞的p-ALK、p-ERK的表達(dá)不受抑制，BIM蛋白表達(dá)無(wú)上調(diào)趨勢(shì)。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)表明H2228/CR耐藥細(xì)胞中的BIM蛋白的表達(dá)與其耐藥有關(guān)。初步闡明EML4-ALK陽(yáng)性表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌克唑替尼耐藥產(chǎn)生的可能機(jī)制，BIM在誘導(dǎo)EML4-ALK陽(yáng)性表達(dá)的人肺腺癌細(xì)胞株H2228對(duì)克唑替尼產(chǎn)生耐藥發(fā)揮重要作用，提示BIM可作為克服克唑替尼耐藥的一個(gè)靶點(diǎn)。

肺腫瘤；EML4-ALK融合基因；H2228細(xì)胞；克唑替尼；獲得性耐藥；BIM

肺癌已成為致死率最高的癌癥之一。目前晚期非小細(xì)胞肺癌的治療方式主要是傳統(tǒng)化療，但其療效并不理想。近年來(lái)，分子靶向治療已成為肺癌研究的熱點(diǎn)，克唑替尼是針對(duì)ALK/c-Met雙靶點(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的酪氨酸激酶ATP結(jié)合域競(jìng)爭(zhēng)性相結(jié)合，通過(guò)阻斷該通路的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和促進(jìn)凋亡［1］，其在治療含EML4-ALK的非小細(xì)胞肺癌已取得顯著療效［2］，然而在一段時(shí)間治療后不可避免地出現(xiàn)耐藥［3］。BIM作為促凋亡家族成員之一，現(xiàn)已證實(shí)在腫瘤細(xì)胞耐藥中發(fā)揮重要作用［4］。本研究通過(guò)建立含有ALK融合基因的耐藥細(xì)胞株H2228/CR，觀察ALK下游BIM基因的變化，以探討H2228細(xì)胞在克唑替尼耐藥前后BIM信號(hào)通路的變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞H2228購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。

1.2 主要試劑與儀器

克唑替尼粉末制劑購(gòu)于美國(guó)Selleckchem公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清、胰蛋白酶替代物購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，Western blot儀器設(shè)備購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，ALKⅠ抗、p-ALKⅠ抗，ERKⅠ抗、p-ERKⅠ抗/BIMⅠ抗以及熒光Ⅱ抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Merck公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及建立耐藥細(xì)胞株 H2228耐藥細(xì)胞株的誘導(dǎo)采用克唑替尼濃度遞增的方法。購(gòu)于ATCC公司的人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞株H2228利用二甲基亞砜（DMSO）冷凍保存，細(xì)胞復(fù)蘇采用快速融化法，迅速放入38℃水浴中，1min內(nèi)使其完全融化，離心棄去上清液，細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于10%胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基中。H2228細(xì)胞在含有50 nm/L克唑替尼的培養(yǎng)基中孵育，每72 h換一次培養(yǎng)液；細(xì)胞長(zhǎng)至80%培養(yǎng)瓶后傳代，繼續(xù)孵育在含有50 nm/L克唑替尼的培養(yǎng)基，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后將克唑替尼濃度增加至100 nm/L繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后增加克唑替尼濃度至200 nm/L繼續(xù)培養(yǎng)，依次不斷增加克唑替尼的濃度，直到H2228細(xì)胞在1 000 nmol/L克唑替尼濃度下穩(wěn)定生長(zhǎng)傳代，誘導(dǎo)時(shí)間為8個(gè)月，誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株命名為H2228/CR。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H2228和H2228/CR細(xì)胞按（6～10）×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板，設(shè)6個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后，按濃度梯度法加入含不同濃度的克唑替尼培養(yǎng)液，把細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育72 h后，吸去孔內(nèi)液體，每孔加入MTT液繼續(xù)孵育4 h后再加入DMSO，充分振蕩10min，在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值，計(jì)算出克唑替尼對(duì)H2228/CR及H2228細(xì)胞的IC50，耐藥指數(shù)（resistance index，RI）=H2228/CR細(xì)胞IC50/H2228細(xì)胞IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H2228細(xì)胞與H2228/CR細(xì)胞，以4×105個(gè)/孔、5×105個(gè)/孔、7×105個(gè)/孔的細(xì)胞分別接種于6孔板中（其中H2228、H2228/CR各接種8個(gè)孔），培養(yǎng)24 h，H2228和H2228/CR細(xì)胞加入克唑替尼濃度為300 nmol/L血清培養(yǎng)液，分別將4×105個(gè)/孔接種的細(xì)胞培養(yǎng)72 h，5×105個(gè)/孔接種的細(xì)胞培養(yǎng)48 h，7×105個(gè)/孔接種的細(xì)胞培養(yǎng)24 h，以細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書的操作收集細(xì)胞并染色，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞耐藥前后ALK、p-ALK、ERK、p-ERK、BIM蛋白表達(dá)的影響 收集長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的H2228細(xì)胞和H2228/CR細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，所得總蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，ALKⅠ抗稀釋度為1∶1 000，p-ALKⅠ抗稀釋度為1∶1 500，BIMⅠ抗稀釋度為1∶1 000，兔ERKⅠ抗稀釋度為1∶1 000，p-ERKⅠ抗稀釋度為1∶1 000，鼠Ⅱ抗稀釋度為1∶2 000，兔Ⅱ抗稀釋度為1∶2 000。以肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參照。紅外熒光Ⅱ抗（DyLight 680 conjugate）顯色，掃描分析條帶，以條帶灰度確定蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測(cè)克唑替尼對(duì) H2228細(xì)胞和H2228/CR細(xì)胞增殖抑制的影響

采用克唑替尼濃度遞增方法，經(jīng)過(guò)8個(gè)月誘導(dǎo)，成功建立克唑替尼耐藥細(xì)胞株H2228/CR。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞和H2228/CR細(xì)胞的IC50分別為335 nmol/L和3 418 nmol/L，H2228/CR細(xì)胞的耐藥指數(shù)為10.20。H2228/CR細(xì)胞在不同濃度克唑替尼作用下的細(xì)胞增殖抑制率低于H2228細(xì)胞（P<0.05）。見表1。

表1 不同濃度的克唑替尼處理H 2228細(xì)胞和H 2228/CR細(xì)胞72 h后細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

表1 不同濃度的克唑替尼處理H 2228細(xì)胞和H 2228/CR細(xì)胞72 h后細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

克唑替尼濃度（nmol/L）細(xì)胞株30 90 270 810 H2228/CR 4.15±0.20 6.93±1.41 13.26±1.05 22.39±1.65 H2228 10.62±0.56 22.11±1.06 29.30±1.21 80.40±1.24 t -16.525 54.203 14.435 38.260 P 0.004 <0.001 0.005 0.001

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)克唑替尼對(duì) H2228細(xì)胞和H2228/CR細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)MTT法檢測(cè)H2228細(xì)胞生長(zhǎng)的情況，選用300 nmol/L克唑替尼以不同培養(yǎng)時(shí)間（24 h、48 h、72 h）處理 H2228細(xì)胞和 H2228/CR細(xì)胞，檢測(cè)其細(xì)胞凋亡率。結(jié)果H2228細(xì)胞凋亡率分別為（19.17±0.63）%、（28.18±1.49）%、（43.54±3.18）%；H2228/CR細(xì)胞凋亡率分別為（3.33±0.17）%、（6.31±1.62）%、（9.50±1.32）%。結(jié)果顯示克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞有促凋亡作用，且具有時(shí)間依賴性（P<0.05）；H2228/CR細(xì)胞的凋亡率明顯低于H2228細(xì)胞（P＜0.05）。說(shuō)明H2228/CR細(xì)胞對(duì)克唑替尼產(chǎn)生耐藥。見圖1、圖2。

圖1 克唑替尼（300 nmol/L）對(duì)H 2228細(xì)胞和H 2228/CR細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡流式圖

圖2 克唑替尼（300 nmol/L）對(duì)H2228細(xì)胞和H2228/CR細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 Western blot法檢測(cè)ALK、p-ALK、ERK、p-ERK、BIM蛋白的表達(dá)水平

結(jié)果顯示，在H2228/CR細(xì)胞中隨著克唑替尼濃度增加，p-ALK、p-ERK蛋白的表達(dá)不受抑制，BIM蛋白的表達(dá)無(wú)上調(diào)趨勢(shì)。而在H2228細(xì)胞中，p-ALK、p-ERK蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，BIM的三個(gè)異構(gòu)體Bim-s、Bim-L、Bim-exL的表達(dá)逐漸上調(diào)。見圖3。

圖3 克唑替尼（300 nmol/L、1 000 nm ol/L）對(duì)H 2228細(xì)胞和H 2228/CR細(xì)胞培養(yǎng)72 h后的W estern blot法檢測(cè)結(jié)果

3 討論

非小細(xì)胞肺癌的靶向治療已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，EML4-ALK融合基因陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌作為近期發(fā)現(xiàn)的一種新的肺癌亞型，其在肺癌中的發(fā)生率為3%～7%［5］。包括克唑替尼在內(nèi)的以EML4-ALK為靶點(diǎn)的分子靶向藥物，在治療含有ALK融合基因的肺癌患者中取得較好的療效，但一部分患者產(chǎn)生獲得性耐藥。目前對(duì)于克唑替尼耐藥機(jī)制尚未完全闡明，有文獻(xiàn)報(bào)道如基因二次突變（C1156、L1196等）、表皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化等都能引起耐藥的發(fā)生［6，7］。本研究通過(guò)克唑替尼濃度遞增法建立H2228/CR耐藥細(xì)胞株，以MTT法計(jì)算H2228/CR的耐藥指數(shù)為10.20，從而為后續(xù)耐藥機(jī)制的研究奠定了良好基礎(chǔ)。

BIM作為一種促凋亡因子，是bcl-2家族中HB3 only亞家族的成員［8］。其促凋亡作用主要與抗凋亡家族成員如bcl-2、bcl-xL相結(jié)合形成二聚體或多聚體的形式，在線粒體膜上引起細(xì)胞色素C釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［9］。BIM在穩(wěn)定造血細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、腫瘤的發(fā)生等發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。我們的研究發(fā)現(xiàn)克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，且呈時(shí)間依賴性。以克唑替尼作用72 h后檢測(cè)H2228細(xì)胞中ALK、ERK的活化形式p-ALK、p-ERK蛋白的表達(dá)量下降，并隨克唑替尼濃度增加呈下降趨勢(shì)，而BIM蛋白的表達(dá)量增加。我們推測(cè)克唑替尼對(duì)H2228細(xì)胞的促凋亡作用與MAPK/MEK/ERK信號(hào)通路有密切關(guān)系?，F(xiàn)已知活化的ERK通過(guò)磷酸化Bim-exL的Ser導(dǎo)致BIM被蛋白酶體降解，引起B(yǎng)IM表達(dá)水平下調(diào)［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H2228細(xì)胞p-ERK蛋白表達(dá)下調(diào)時(shí)，BIM蛋白表達(dá)量增加。由此說(shuō)明克唑替尼通過(guò)抑制ALK磷酸化來(lái)抑制下游信號(hào)通路MAPK/ MEK/ERK的激活來(lái)上調(diào)BIM蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)H2228細(xì)胞凋亡，這與Luciano等［11］的研究一致。

在獲得H2228/CR耐藥細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)克唑替尼對(duì)其不具有誘導(dǎo)凋亡的作用，而且活化的p-ALK表達(dá)未受到抑制，下游通路中的p-ERK蛋白表達(dá)未見下降，促凋亡蛋白BIM未見上調(diào)。目前引起克唑替尼耐藥機(jī)制主要有ALK激酶區(qū)域突變、信號(hào)傳導(dǎo)旁路的激活、ALK融合基因拷貝數(shù)目的增加等［12］。現(xiàn)公認(rèn)的耐藥機(jī)制是激酶區(qū)域ATP結(jié)合位點(diǎn)的突變［13］，這可能是本實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致H2228細(xì)胞耐藥的原因。Katayama等［14］研究發(fā)現(xiàn)在ALK融合基因肺癌細(xì)胞中ATP結(jié)構(gòu)域的gatekeeper處檢測(cè)到L1196M突變，使ALK空間構(gòu)象發(fā)生改變阻止克唑替尼結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)中p-ALK持續(xù)活化可能是由于ALK激酶區(qū)突變阻礙克唑替尼與ALK結(jié)合導(dǎo)致，從而激活下游通路，抑制促凋亡蛋白BIM的增加。Song等［15］通過(guò)對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變的肺腺癌耐藥細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用酪氨酸激酶抑制劑（TKI）時(shí)，下游通路MAPK/MEK/ ERK仍能再次被激活，說(shuō)明下游信號(hào)傳導(dǎo)可能繞過(guò)EGFR靶點(diǎn)向下傳導(dǎo)產(chǎn)生耐藥。另外，Ng等［16］研究證實(shí)BIM基因缺失多態(tài)性與吉非替尼耐藥有關(guān)，在EGFR基因突變患者中，有BIM基因多態(tài)性患者對(duì)吉非替尼的療效較無(wú)BIM多態(tài)性者差。這些耐藥機(jī)制是否與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)還需進(jìn)一步研究。

本研究表明，BIM在誘導(dǎo)EML4-ALK陽(yáng)性表達(dá)的人肺腺癌細(xì)胞株H2228對(duì)克唑替尼產(chǎn)生耐藥發(fā)揮重要作用，闡明了EML4-ALK陽(yáng)性表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌克唑替尼耐藥產(chǎn)生的可能機(jī)制，提示BIM可作為克服克唑替尼耐藥的一個(gè)靶點(diǎn)，為未來(lái)逆轉(zhuǎn)耐藥提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)存在一些不足之處，有待今后研究進(jìn)一步完善，如利用基因干擾技術(shù)抑制BIM基因蛋白的表達(dá)，以同樣條件的克唑替尼處理沉默BIM基因前后的H2228細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，以進(jìn)一步闡明BIM在H2228/CR耐藥細(xì)胞中的作用。有關(guān)方面有待深入研究。

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［2014-10-24收稿］［2014-11-25修回］［編輯 阮萃才］

Role of BIM signaling in crizotinib-induced apoptosis in the EM L4-ALK-positive lung adenocarcinom a cell line H 2228

WEI Jiang1，2，PENG Haiyan1，2，SU Cuiyun1，SONG Xiangqun1，WANG Huilin1，NING Ruiling1，ZHOU Shaozhang1（1Department of Chemotherapy，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ZHOU Shaozhang.E-mail：179913337@qq.com

Objective To establish a crizotinib-resistant line of the EML4-ALK-positive lung adenocarcinoma cell line H2228 and compare it with the crizotinib-sensitive parental line to examine the possible role of BIM in crizotinib-induced apoptosis.M ethods H2228 human lung cellswere exposed to gradually increasing doses of crizotinib（50，100，200，500，1000 nmol/L）to create a crizotinibresistant line（H2228/CR）.Then H2228/CR and parental H2228 cellswere exposed to different doses of crizotinib，and their growth was compared using the MTT assay，while levels of apoptosiswere compared using flow cytometry.Western blottingwas used to compare levels of ALK，p-ALK，ERK，p-ERK and BIM in the two cell lines.Results After 8 months of crizotinib selection，the resistant lineH2228/CR showed an IC50of 3，418 nmol/L compared to 335 nmol/L for the parental H2228 line.The RI for H2228/CR cells was 10.20.Crizotinib inhibited the growth of H2228/CR cells to a much smaller extent than it inhibited H2228，and it led to a much smaller proportion of apoptotic cells in H2228/CR cultures.Levels of phospho-ERK were higher in H2228/CR cells，implying downregulation of BIM.Conclusion BIM may help mediate crizotinib-induced apoptosis in lung cancer，and its down-regulation may contribute to crizotinib resistance.

Lung neoplasm；EML4-ALK fusion gene；H2228 cell；Crizotinib；Acquired resistance；BIM

R734.2

A

1674-5671（2015）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.01.01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260357）

周韶璋。E-mail：179913337@qq.com