汪元符

（南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330038）

抗炎抗風濕功效中成藥中非法添加非甾體抗炎藥及激素類成分的檢測

汪元符

（南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330038）

目的：針對抗炎抗風濕功效類中成藥，建立可能非法添加的對乙酰氨基酚等10種非甾體抗炎藥成分及地塞米松等3種糖皮質(zhì)激素成分的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢測方法。方法：色譜柱為PHenomenex Luna C18（2）100A（150 mm×2.00 mm，3 μm）；柱溫為40℃；流動相為10 mmol/L甲酸銨（以甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）及乙腈，梯度洗脫；流速為0.2 mL/min；以優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)采集信號。結(jié)果：各成分檢出限濃度為0.1～2 ng/mL；定量限濃度為0.5～ 5 ng/mL；線性范圍為各成分定量限～100 ng/mL；在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均在0.99以上；平均加樣回收率為93.0%～ 102.7%。結(jié)論：本方法簡便，快速，準確，靈敏度高，專屬性好；能用于抗炎抗風濕功效類中成藥中非法添加的快速檢測。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；抗炎抗風濕功效類中成藥；非甾體抗炎藥；糖皮質(zhì)激素

在食品藥品監(jiān)督管理部門日常的監(jiān)督抽檢、風險監(jiān)測及投訴舉報受理的工作中，抗炎抗風濕功效類中成藥非法添加非甾體抗炎藥及激素的情況時有發(fā)生，嚴重危害著人民群眾的用藥安全?，F(xiàn)行法規(guī)標準在檢測此類非法添加時，方法繁瑣，需經(jīng)3個不同色譜系統(tǒng)?；谔岣吖ぷ餍剩黾臃欠ㄌ砑涌珊Y查成分，提高檢測方法的靈敏度、準確度、精確度的原因，本實驗室建立了以下有效的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，以一種色譜系統(tǒng)，電噴霧離子源正、負離子同時監(jiān)測，可同時檢測多種非甾體抗炎藥及激素，能夠滿足平時的監(jiān)督檢驗需要。

1 儀器、試劑與材料

AB Sciex 4000 Qtrap質(zhì)譜，ekspert ultraLC100高效液相色譜儀，METTLER TOLEDO ME204E電子分析天平，METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，昆山KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，TG16-WS臺式高速離心機（湘儀離心機），Millipore超純水系統(tǒng)。

甲醇（色譜純，Merck），乙腈（色譜純，Merck），甲酸（色譜純，天津科密歐），甲酸銨（色譜純，武漢偉琪博星）。

對照品：對乙酰氨基酚（100018-200408）、布洛芬（100179-201105）、萘普生（100198-201205）、氨基比林（100503-200301）、甲氧芐啶（100031-200304）、雙氯芬酸鈉（100334-200302）、尼美舒利（100555-200501）、保泰松（100481-200601）、吡羅昔康（100177-200603）、吲哚美辛（100258-200904）、氫化可的松（100152-200206）、地塞米松（100129-201105）、醋酸潑尼松（100012-200706），均為中國食品藥品檢定研究院提供。

樣品：購自流通企業(yè)或醫(yī)療機構(gòu)。舒筋健腰丸（規(guī)格：45 g/瓶，批號：130701），追風透骨丸（規(guī)格：36 g/瓶，批號：131102），木瓜丸（規(guī)格：0.18 g× 240丸 /瓶，批號：140722），活絡(luò)消痛片（規(guī)格：0.35 g/片，批號：140301），復(fù)方夏天無片（規(guī)格：0.3 g/片，批號：140710），尪痹片（規(guī)格：0.5 g/片，批號：140302），腰息痛膠囊（規(guī)格：0.3 g/粒，批號：141016），野木瓜膠囊（規(guī)格：0.45 g/粒，批號：131207），痹祺膠囊（規(guī)格：0.3 g/粒，批號：131015），祛風止痛膠囊（規(guī)格：0.3 g/粒，批號：140105）。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜分析條件

分析柱：PHenomenexLunaC18（2）100A（150 mm× 2.00 mm，3 μm）；柱溫：40℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：5 μL；流動相：A為10 mmol/L甲酸銨（以甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0），B為乙腈。按表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式（ESI+）、負離子模式（ESI-）；掃描模式：MRM；掃描范圍：50～600 Da；Curtain Gas（CUR）：25；Collision Gas（CAD）：Medium。IonSpray Vottage（IS）：正5 500，負4 500；Temperature（TEM）：500；Ion Source Gas1（GS1）：55；Ion Source Gas2（GS2）：50；Interface Heater（ihe）：on。離子對選擇（MRM Ion Pairs）見表2。

2.3 對照品溶液的配制

取對乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、氨基比林、甲氧芐啶、雙氯芬酸鈉、尼美舒利、保泰松、吡羅昔康、吲哚美辛、氫化可的松、地塞米松、醋酸潑尼松對照品各約10 mg，精密稱定，以甲醇制成每1 mL中各含 1 mg的溶液作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備溶液 1 mL，以 50%甲醇，制成各含200 ng/mL的溶液，作為對照品儲備液。對照品儲備液以50%甲醇等比稀釋，可得到各含 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0 ng/mL的標準系列溶液。

表2 質(zhì)譜分析

2.4 供試品溶液的配制

將10批分別為丸劑、片劑、膠囊劑（取內(nèi)容物）的樣品研細，各取約 0.50 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加入50%甲醇約80 mL，超聲處理20 min，放冷至室溫，以 50%甲醇定容，搖勻，以 10 000 r/min離心 10 min后，取上清液，以50%甲醇溶液稀釋10～ 100倍，用0.2 μm的濾頭濾過，取續(xù)濾液測定。

2.5 對照品定量離子對（50 ng/mL）提取質(zhì)譜圖

見圖1～13。

2.6 定性確認

圖1 甲氧芐啶：292.1/231.1提取質(zhì)譜圖注：ESI+，tR為1.69 min

圖2 對乙酰氨基酚：152.1/110.3提取質(zhì)譜圖注：ESI+，tR為3.05 min

采用保留時間與對照品相一致，且定性與定量離子對相對離子豐度比應(yīng)滿足表3要求，判為檢出。

圖3 氨基比林：232.0/113.3提取質(zhì)譜圖注：ESI+，tR為3.73 min

圖4 氫化可的松：363.2/121.3提取質(zhì)譜圖注：ESI+，tR為10.45 min

圖5 地塞米松：391.3/361.3提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為11.11 min

圖6 吡羅昔康：329.9/146.1提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為11.57 min

圖7 醋酸潑尼松：399.2/339.3提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為11.92 min

圖8 萘普生：228.9/169.8提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為12.27 min

圖9 尼美舒利：308.0/229.9提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為13.09 min

圖10 吲哚美辛：356.2/312.1提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為14.12 min

圖11 雙氯芬酸鈉：294.0/250.0提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為14.15 min

圖12 布洛芬：205.1/160.9提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為14.85 min

各對照品試驗結(jié)果如表4所示。

圖13 保泰松：308.2/280.0提取質(zhì)譜圖注：ESI-，tR為15.30 min

表3 定性與定量離子對相對離子豐度比 （%）

表4 對照品試驗結(jié)果

2.7 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察

采用“2.1”項下的色譜條件，“2.2”項下的質(zhì)譜條件，以“2.3”項下的標準系列溶液進樣檢測。以檢測所得峰面積為縱坐標，以標準系列溶液濃度（ng/mL）為橫坐標，進行線性擬合。以定性離子對和定量離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比均大于3時的濃度（ng/mL）為檢出限。以定性離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比大于3，定量離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比大于10時的濃度（ng/mL）為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于 0.99，為線性范圍。結(jié)果表5。

2.8 精密度試驗

選用標準系列溶液中各成分濃度為10.0 ng/mL的標準溶液，連續(xù)進樣6針，以提取的定量離子對質(zhì)譜圖峰面積計算。結(jié)果見表6，各組分RSD值均在0.32%～ 0.84%之間。

表5 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察結(jié)果

表6 精密度試驗結(jié)果

2.9 穩(wěn)定性試驗

選用標準系列溶液中各成分濃度為10.0 ng/mL的標準溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分別進樣，以提取的定量離子對質(zhì)譜圖峰面積計算。結(jié)果如表7，各組分RSD值均在0.79%～ 1.58%之間。

表7 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.10 回收率試驗

取丸劑（舒筋健腰丸）、片劑（活絡(luò)消痛片）、膠囊劑（腰息痛膠囊）各1份，如“2.4”項下平行稱樣各3份，分別加入50，200，500 μL每1 mL中各含1 mg的對照品儲備液，置 100 mL量瓶中，加入50%甲醇約 80 mL，超聲處理 20 min，放冷至室溫，以50%甲醇定容，搖勻，以10 000 r/min離心10 min后，取上清液，以 50%甲醇溶液稀釋 100倍，用0.2 μm的濾頭濾過，取續(xù)濾液測定。則丸劑、片劑、膠囊劑的3份平行樣最終加標濃度分別為5，20，50 ng/mL。以5次平行測定結(jié)果的均值與加標濃度相比較，回收率結(jié)果見表8，不同劑型各組分高、中、低3個濃度的回收率均在93.0%～102.7%之間。

2.11 樣品測定結(jié)果

檢測了10批抗炎抗風濕中成藥，結(jié)果均為陰性。

3 討論

3.1 流動相的選擇

試用了不同種類、比例、pH值的流動相，如：水-甲醇、水-乙腈、0.2%甲酸水-甲醇、0.2%甲酸水-乙腈、10 mmol/L甲酸銨-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-乙腈-四氫呋喃。試用了不同梯度洗脫方式。以本法所選用的流動相：A（10 mmol/L甲酸銨以甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）-B（乙腈）采用的洗脫方式，13種成分檢測靈敏度均能達到滿意。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

13種成分均同時采用ESI+及ESI-檢測，根據(jù)試驗結(jié)果，選用靈敏度高的一種方法。選用靈敏度最高的一組離子對作為定量離子對，再選擇靈敏度次高的一組離子對作為定性離子對。

3.3 供試品提取方法選擇

試驗表明，以甲醇或50%甲醇超聲提取，沒有明顯區(qū)別，考慮到溶液強度及在色譜中的擴散，采用50%甲醇比較有利；超聲15 min即可有效提取所測組分，采用20 min較穩(wěn)妥。

表8 回收率試驗結(jié)果

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（收稿日期：2015-06-16）

Detection of Non-steroidal Anti-inflammatory Drug and Glucocorticoid Added Illegally in Anti-inflammatory and Antirheumatic Traditional Chinese Medicine

Wang Yuanfu （Nanchang Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang 330038，China）

Objective：To establish a HPLC-MS/MS method for the detection of acetaminophen，dexamethasone and other 10 kinds of non-steroidal anti-inflammatory drugs and 3 kinds of glucocorticoid in anti-inflammatory and antirheumatic traditional Chinese medicines.Methods：PHenomenex Luna C18（2）100A column（150 mm×2.00 mm，3 μm）was used，the column temperature was at 40℃，the mobile phase was 10 mmol/L ammonium formate（pH 3.0）-acetonitrile，using gradient elution method，the flow rate was 0.2 mL/min and optimization MS/MS method was adopted.Results：The detection limit of this method was 0.1～ 2 ng/mL，the limit of quantitation was 0.5～5 ng/mL and the linear range was the limit of quantitation～ 100 ng/mL.The test results showed the related coefficient in the linear range was more than 0.99.The average recovery of the method was 93.0% ～ 102.7%. Conclusion：This method is simple，rapid and accurate with a high sensitivity and specificity.It can be used for the quick detection of illegally added materials in anti-inflammatory and antirheumatic traditional Chinese medicines.

HPLC-MS/MS；Anti-inflammatory and Antirheumatic Traditional Chinese Medicines；Non-steroidal Anti-inflammatory Drug；Glucocorticoid

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.11.005

2015-06-28）

表5 兩組患者的療效比較

注：治療組與對照組比較P=0.036 1

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3 討論

汪元符，男，主管藥師。研究方向：中藥理論、藥物檢測及食品安全。E-mail：wanngel@126.com

目前，國內(nèi)的中醫(yī)藥治療糖尿病足依然缺乏統(tǒng)一標準、統(tǒng)一操作規(guī)程以及缺乏截肢率、潰瘍的發(fā)生率、醫(yī)療費用等大樣本流行病學資料支持中醫(yī)藥治療糖尿病足的效果分析。本實驗以中藥藥敏的方法研究黃連液最佳使用濃度和麝香的最佳使用劑量，可以作為解決中醫(yī)藥對糖尿病足治療在藥物選擇、劑量確定缺乏統(tǒng)一標準現(xiàn)狀下的方法之一。通過本實驗發(fā)現(xiàn)，黃連液聯(lián)合麝香比原組方的抑菌作用明顯增強，對于那些抗菌藥物無效的多重耐藥菌，黃連液和麝香能起到明顯的殺菌和抑菌作用，中藥將成為控制糖尿病足細菌感染的另一最佳的選擇，為臨床治療糖尿病足提供了一種新的有效方法。