劉鴻雁，吳 晶，劉麗娜，袁文珺，吳丹楓，賈 忠，△

1蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046；2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)；3蘭州市中醫(yī)醫(yī)院

一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定蒼柏祛痛膠囊中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的含量*

劉鴻雁1，吳 晶2，3，劉麗娜1，袁文珺3，吳丹楓2，賈 忠1，2△

1蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046；2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)；3蘭州市中醫(yī)醫(yī)院

目的：建立蒼柏祛痛膠囊中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的一測(cè)多評(píng)含量測(cè)定方法。方法：采用反相H PLC法，色譜柱：W at ers X SELECTCSH-C18(4.6 m m×150 m m，5.0 μm)；柱溫：30℃；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫；流速1.0 m L/m i n；紫外檢測(cè)波長284 nm。以鹽酸小檗堿為對(duì)照，建立鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿之間的校正因子，計(jì)算鹽酸黃柏堿的含量。分別采用外標(biāo)法和一次多評(píng)法測(cè)定蒼柏祛痛膠囊中鹽酸黃柏堿的含量，將兩種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：6批藥品一測(cè)多評(píng)法的計(jì)算值和外標(biāo)法測(cè)定值間無顯著差異，實(shí)驗(yàn)所得的相對(duì)校正因子可信。結(jié)論：用一測(cè)多評(píng)法對(duì)蒼柏祛痛膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制是可行的、準(zhǔn)確的。

蒼柏祛痛膠囊；高效液相色譜法；一測(cè)多評(píng)法；鹽酸小檗堿；鹽酸黃柏堿；校正因子

“蒼柏祛痛膠囊”源于甘肅省名老中醫(yī)賈奇峰的經(jīng)典驗(yàn)方“痛風(fēng)散”，主要由黃柏、蒼術(shù)、川牛膝、防己等14味藥組成，多年來運(yùn)用于痛風(fēng)的臨床治療，具有清熱利濕，祛瘀降濁，通絡(luò)止痛之效，能夠緩解痛風(fēng)急性發(fā)作期的紅、腫、熱、痛等癥狀，還可控制痛風(fēng)患者血尿酸水平，達(dá)到防止痛風(fēng)復(fù)發(fā)的目的［1-6］。方中以黃柏、蒼術(shù)為君藥，黃柏堿為黃柏中的特有成分，小檗堿為黃柏生物堿中含量較高的成分［7-8］，因此，本研究以黃柏堿及小檗堿作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳含量測(cè)定方法，既能較好地反映其質(zhì)量又具有專屬性，能更加有效地控制該中藥處方的質(zhì)量。

1 材料

1.1 材料 色譜純乙腈(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130514278)；磷酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：090919)；純化水。對(duì)照品鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿(批號(hào)：110713-201212、111895-201202)均購自中國食品藥品鑒定研究院；蒼柏祛痛膠囊樣品(蘭州市肺科醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)：20131218、20140121、20140226、20140312、20140415、20140513)。

1.2 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；FA2004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器(功率250 W，頻率50 kHz，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：Waters XSELECT CSH-C18(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：284 nm；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫，0～15分鐘乙腈比例(10→18)，15～25分鐘乙腈比例(18→40)。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿對(duì)照品適量，加乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)制成每1 mL含鹽酸小檗堿42.24 μg、鹽酸黃柏堿75.2 μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 參考《中國藥典》2010版一部黃柏含量測(cè)定項(xiàng)下方法［9］，取本品約2.0 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙腈-0.1%磷酸水(36∶64) 25 mL，稱定重量，超聲處理30分鐘(功率250 W，頻率50 kHz)，放冷，再稱定重量，用乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺黃柏藥材的陰性樣品2.0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性供試品溶液，備用。

2.3 線性關(guān)系的考察 取鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)制成每1 mL含鹽酸小檗堿42.24μg、鹽酸黃柏堿75.20 μg的混合溶液，搖勻，作為儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備溶液 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰的峰面積，鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿的RSD分別為0.61%、1.34%，結(jié)果表明精密度良好。

2.5 校正因子的計(jì)算 根據(jù)校正因子的計(jì)算公式fk/m=fk/fm= (Wk×Am)/(Wm×Ak)［10-11］，以黃柏中鹽酸小檗堿為內(nèi)標(biāo)，建立其與鹽酸黃柏堿之間的校正因子，通過校正因子計(jì)算鹽酸黃柏堿的含量。式中Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量；Am為待測(cè)組分m的峰面積；Wm為待測(cè)組分m的質(zhì)量。在實(shí)際測(cè)定時(shí)，用外標(biāo)法測(cè)定鹽酸小檗堿的含量，再通過校正因子計(jì)算鹽酸黃柏堿的含量，同時(shí)用常規(guī)外標(biāo)法進(jìn)行同步測(cè)定，以驗(yàn)證計(jì)算值的正確性和可行性。根據(jù)以上公式，結(jié)合對(duì)照品溶液的不同進(jìn)樣量所得峰面積數(shù)據(jù)，以鹽酸小檗堿為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算鹽酸小檗堿對(duì)鹽酸黃柏堿的校正

因子(fk/m)，見表2。

表2 校正因子計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、12小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰的峰面積，得鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿峰面積的RSD值分別為0.79%、1.23%，結(jié)果表明在0～12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品5份，按照樣品制備方法進(jìn)行樣品處理，分別進(jìn)樣測(cè)定，得到鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿總量的RSD分別為0.44%、0.71%、0.64%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批號(hào)樣品(鹽酸小檗堿0.695 0 mg/g，鹽酸黃柏堿0.077 2 mg/g)粉末約1.0 g，精密稱定，加入一定量的鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿，依法測(cè)定，根據(jù)色譜峰峰面積值，分別求得鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿的含量，計(jì)算回收率，得到RSD分別為1.05%、0.95%，結(jié)果表明，本法回收率好，見表3。

2.9 樣品的測(cè)定 取6批蒼柏祛痛膠囊樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿的含量，見表4。

2.10 校正因子的系統(tǒng)適應(yīng)性考察

2.1 0.1 不同色譜柱及高效液相色譜儀考察 取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件，依次進(jìn)樣1、5、10、20 μL，按“2.7”項(xiàng)下計(jì)算鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿之間的校正因子?？疾霿aters 2695，Agilent 1100兩種高效液相色譜系統(tǒng)和XSelect HSS C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm)，XSelect CSH-C18column (150 mm×4.6 mm，5 μm)，及Symmetry C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱，結(jié)果見表5。

表3 回收率結(jié)果

2.1 0.2 待測(cè)組分色譜峰的定位 “內(nèi)標(biāo)校正法”在實(shí)際應(yīng)用中利用相對(duì)校正因子計(jì)算含量，無需用組分的色譜峰進(jìn)行定位。對(duì)于成分復(fù)雜的樣品，色譜圖中除待測(cè)組分色譜峰外，還存在多個(gè)其他色譜峰，因此，對(duì)待測(cè)組分色譜峰的正確定位是準(zhǔn)確測(cè)定的前提。利用相對(duì)保留值定位：知道內(nèi)參物的保留時(shí)間，加上相對(duì)保留值，再根據(jù)峰形判斷，即能正確判斷出目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置，結(jié)果RSD＜1%，表明利用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行峰的定位是可行的，見表6。

2.1 0.3 內(nèi)標(biāo)校正法測(cè)定樣品含量 取6批樣品，精密稱取約2.0 g，按“2.3”項(xiàng)下操作，制成供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣分析，測(cè)定。采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)校正法計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的含量，得到RSD＜3%，見表7。

表7 用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)校正法所測(cè)樣品中鹽酸小檗堿及鹽酸黃柏堿含量

3 討論

3.1 提取溶劑、方法及提取時(shí)間的選擇 根據(jù)生物堿類成分的性質(zhì)，考察甲醇、乙腈、乙腈-0.1%磷酸水等提取溶劑，采用超聲、回流法提取，選擇出最佳提取方法為乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)超聲提取30分鐘。

3.2 檢測(cè)波長的選擇 采用PDA檢測(cè)器在200～400 nm掃描，綜合考慮鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的吸收光譜，使2組分均有較大吸收，選用284 nm為檢測(cè)波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇 為保證各指標(biāo)成分得到良好分離，考察甲醇-水系統(tǒng)，乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水等度系統(tǒng)及梯度系統(tǒng)，結(jié)果采用乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫系統(tǒng)兩個(gè)成分得到了良好分離，各峰之間的分離度均大于1.5，所建立的方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，為蒼柏祛痛膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)蒼柏祛痛膠囊中的主要有效成分鹽酸小檗堿及鹽酸黃柏堿進(jìn)行了含量測(cè)定，由于鹽酸黃柏堿含量較低且在液相中相應(yīng)值很低，限制了這一主要活性成分的含量測(cè)定。本研究建立了鹽酸小檗堿及鹽酸黃柏堿間的相對(duì)校正因子，在測(cè)定鹽酸小檗堿含量的基礎(chǔ)上，利用該校正因子對(duì)鹽酸黃柏堿進(jìn)行含量換算，結(jié)果表明該方法測(cè)得鹽酸黃柏堿的含量與外標(biāo)法測(cè)得鹽酸黃柏堿含量無顯著性差異。本研究為制劑中黃柏藥材的定量控制，為蒼柏祛痛膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新的方法，同時(shí)為蒼柏祛痛膠囊的進(jìn)一步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作提供了依據(jù)。

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Determination ofBerberine Hydrochloride and Phellodendrine Hydrochloride in CangBai QuTong Capsules Simultaneously by Quantitative Analysis ofMulti-components by Single Marker

LIU Hongyan1,WU Jing2,3,LIU Lina1,YUAN Wenjun3,WU Danfeng2,JIA Zhong1,2△
1 Lanzhou Municipal Lung Hospital,Lanzhou 730046,China;
2 Gansu Agricultural University;3 Lanzhou Municipality TCM Hospital

Objective:To establish the method of quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS)for determining berberine hydrochloride and phellodendrine hydrochloride in CangBai QuTong capsules. Methods:Reversed HPLC method was adopted,chromatographic column:Waters XSELECT CSH-C18(4.6 mm× 150 mm,5.0 μm);column temperature:30℃;mobile phase:acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution,gradient elution;flow rate:1.0mL/min;UV detection wavelength:284 nm.Berberine hydrochloride was taken as the control, correction factors between berberine hydrochloride and phellodendrine hydrochloride were established to calculate the contents of phellodendrine hydrochloride.The contents of phellodendrine hydrochloride in CangBai QuTong capsules were determined by external standard method and QAMS,and the results were compared.Results:The values of QAMS were compared with the ones of external standard method in six batches of the herbs,and there was no significant difference,obtained relative correction factor(RCF)was credible in the experiments.Conclusion:It is feasible and accurate for quality control of CangBai QuTong capsules by QAMS.

CangBai QuTong capsules;HPLC;quantitative analysis of multi-components by single marker; berberine hydrochloride;phellodendrine hydrochloride;correction factors

R917.1

A

1004-6852(2015)11-0023-04

2015-05-09

甘肅省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(編號(hào)G ZK-2012-55)；蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)2014-RC-70)。

劉鴻雁(1979—)，女，碩士學(xué)位，主管藥師。研究方向：藥物鑒別和分析。

△通訊作者：賈忠(1964—)，男，碩士學(xué)位，主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)和新藥開發(fā)。