胡曉琴，邱 皓△，呂曉云，劉 文，李艷芬，滕玉蓮，陶小紅

1甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2蘭州大學(xué)

康腎合劑對(duì)酒精性腎損害大鼠腎組織NF-κB活化及IL-6水平的影響*

胡曉琴1，邱 皓1△，呂曉云2，劉 文1，李艷芬1，滕玉蓮2，陶小紅1

1甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2蘭州大學(xué)

目的：探討中藥康腎合劑(KSP)對(duì)酒精性腎損害模型大鼠腎組織核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)活化及白細(xì)胞介素6(IL-6)水平的影響。方法：將SD雄性大鼠66只隨機(jī)分為正常組、酒精組、中藥組各22只。正常組給予生理鹽水灌胃，酒精組給予無(wú)水乙醇每日2次灌胃，中藥組在給予同酒精組等量乙醇基礎(chǔ)上，加用KSP水煎劑每日2次灌胃，共12周。于實(shí)驗(yàn)第4周、8周、I2周末采用免疫組化法及ELISA法檢測(cè)腎組織NF-κB活化及IL-6水平變化。結(jié)果：酒精組大鼠腎組織NF-κB活化較正常組顯著上調(diào)，IL-6水平明顯上升(P＜0.05)；中藥組NF-κB活化及IL-6水平明顯低于酒精組(P＜0.05)。結(jié)論：KSP干預(yù)酒精性腎損害的作用機(jī)制可能與其抑制NF-κB活化、降低IL-6水平有關(guān)。

酒精性腎損害；康腎合劑；核轉(zhuǎn)錄因子κB；白細(xì)胞介素6

過(guò)量飲酒是世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。相關(guān)研究證實(shí)，乙醇可誘發(fā)以腎小管-間質(zhì)損害為主的腎臟病理改變，其結(jié)果可進(jìn)展至腎間質(zhì)纖維化、慢性腎功能衰竭［1］。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中藥活血利濕方對(duì)大鼠酒精性腎損害具有良好的干預(yù)作用［2］。本研究在建立酒精性腎損害動(dòng)物模型的同時(shí)，以復(fù)方中藥康腎合劑(Ka n g s h e n P rescr ip t i o n，K S P)灌胃，研究K S P對(duì)酒精性腎損害模型大鼠腎組織核轉(zhuǎn)錄因子κB (N F-κB)活化及血清白細(xì)胞介素6(I L-6)水平的影響，進(jìn)一步探討K S P干預(yù)酒精性腎損害的可能機(jī)制，為K S P臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 無(wú)水乙醇(分析純，沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠)；小鼠抗大鼠N F-κB p65多克隆抗體(美國(guó)S a n ta C r u z公司，武漢博士德生物工程有限公司分裝)；免疫組化檢測(cè)試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司提供)；大鼠I L-6 E L I S A試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供)；K S P藥物組成：黃芪50g，當(dāng)歸20 g，枸杞子20 g，紅花15 g，連翹20 g，白茅根30 g，薏苡仁30 g。藥物均購(gòu)自甘肅省藥材公司，經(jīng)鑒定符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。加5倍體積水，煎30分鐘，同法煎煮2次，2次煎煮藥液混合(含生藥2.6 g/m L)，冷藏備用，采用高效液相控制藥物質(zhì)量。

1.2 動(dòng)物分組、模型復(fù)制及給藥方法 清潔級(jí)S D雄性大鼠66只，體質(zhì)量(180±20)g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(甘動(dòng)準(zhǔn)14-006)。動(dòng)物分組、模型復(fù)制及給藥方法參照文獻(xiàn)［2］方法進(jìn)行。

1.3 免疫組織化學(xué)染色(SP)法 分別取灌胃4周末、8周末、12周末正常組大鼠各6只及酒精組、中藥組各8只，斷頭處死，迅速摘取腎臟，制備腎組織切片。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水洗，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波抗原修復(fù)，加小鼠抗大鼠N F-κB p65多克隆抗體一抗(1∶75)，標(biāo)本置濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，滴加生物素化羊抗兔二抗I g G(1∶100)，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素，D A B顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。以P B S代替一抗作陰性對(duì)照，以博士德公司提供的扁桃腺切片作陽(yáng)性對(duì)照。每鼠6張切片。應(yīng)用彩色病理圖文分析系統(tǒng)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡放大400倍攝取圖像，輸入圖像分析系統(tǒng)內(nèi)，分別進(jìn)行腎小球與腎小管中N F-κB活化檢測(cè)：每張切片隨機(jī)選取5個(gè)腎小球，計(jì)算每個(gè)腎小球中染色區(qū)域面積占整個(gè)腎小球面積的百分比，以均值表示每例腎小球中陽(yáng)性信號(hào)面積；計(jì)算每張切片皮質(zhì)區(qū)60個(gè)高倍視野下陽(yáng)性小管數(shù)與總腎小管數(shù)的百分?jǐn)?shù)，以均值表示每例腎小管中的陽(yáng)性率。

1.4 ELISA法檢測(cè)IL-6 分別于灌胃4、8、12周末處死動(dòng)物，留取腎臟，制備腎組織勻漿，參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。另取上清液，采用美國(guó)P i erce公司蛋白分析試劑盒測(cè)定上清液蛋白含量。結(jié)果判定：腎組織I L-6蛋白含量(n g/g)=腎組織勻漿上清液I L-6濃度(n g/L)/組織勻漿上清液蛋白定量(g/L)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用S P SS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用方差分析，組間多重比較采用L S D-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KSP對(duì)酒精性腎損害模型大鼠腎組織NF-κB活化的影響 鏡下胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，表明存在腎組織N F-κB活化。正常組可見(jiàn)少部分腎小球系膜細(xì)胞和遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞有微弱N F-κB活化；酒精組腎小球系膜細(xì)胞、髓質(zhì)區(qū)腎小管上皮細(xì)胞和集合管有較強(qiáng)活化，活化信號(hào)位于胞漿及胞核核周；中藥組腎組織中N F-κB活化信號(hào)低于酒精組(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 KSP對(duì)酒精性腎損害模型大鼠腎組織IL-6水平的影響 隨著酒精刺激時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的不斷加大，酒精組I L-6水平較正常組升高(P＜0.05)，與酒精組比較，中藥組I L-6顯著降低，接近正常組(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 腎組織中NF-κB活化情況(±s) %

表1 腎組織中NF-κB活化情況(±s) %

注：與正常組比較，△表示P＜0.01；與酒精組比較，#表示P＜0.05,##表示P＜0.01。

組別例數(shù) 4周 8周 12周腎小球 腎小管 腎小球 腎小管 腎小球 腎小管正常組 18 1.52±0.42 7.32±2.19 1.63±0.48 8.24±4.51 1.69±0.47 8.36±2.65酒精組 24 15.24±4.53△37.63±10.32△31.28±8.19△54.38±14.28△46.71±14.78△69.85±8.23△中藥組 24 9.72±2.62#24.36±7.09#13.18±3.76##28.14±7.51##14.67±4.92##29.36±8.65##

表2 腎組織IL-6水平變化情況(±s) ng/g

表2 腎組織IL-6水平變化情況(±s) ng/g

注：與正常組比較，△表示P＜0.01；與酒精組比較，#表示P＜0.05,##表示P＜0.01。

組別 例數(shù) IL-6 4周 8周 12周正常組 18 325.64±83.12 336.72±92.34 338.69±91.81酒精組 24 413.57±112.73△442.85±113.45△462.27±121.68△中藥組 24 382.16±102.43#375.36±108.15##347.81±89.27##

3 討論

業(yè)已證實(shí)，炎癥反應(yīng)與酒精性腎損害密切相關(guān)。N F-κB是真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄中重要的因子。活化的N F-κB可誘導(dǎo)多種炎癥性細(xì)胞因子、趨化因子(如I L-6、M C P-1)、細(xì)胞黏附分子及細(xì)胞外基質(zhì)成分等的基因表達(dá)，參與腎損害的發(fā)病過(guò)程［3］。因此，N F-κB作為上游調(diào)控因子，在酒精性腎損害的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起至關(guān)重要作用，而抑制N F-κB活性，可從基因水平上抑制腎損害［4］。I L-6在腎小球硬化、腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程中起重要促進(jìn)作用，可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞其他細(xì)胞因子的表達(dá)，從而催化和放大炎癥反應(yīng)。在多種腎臟疾病中，I L-6可促進(jìn)其發(fā)展，其在腎臟中的高表達(dá)與腎小球系膜增生、腎小管萎縮呈正相關(guān)［5］，其分泌與M C P-1的調(diào)控有關(guān)［6］。本研究結(jié)果顯示，隨著酒精負(fù)荷時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠腎組織N F-κB活化逐漸增強(qiáng)，活化的N F-κB主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，僅有少量表達(dá)于腎小球固有細(xì)胞，并伴隨腎功能損害，此與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］。尤以腎小管為著，同時(shí)伴隨血清I L-6的升高。經(jīng)K S P灌胃干預(yù)后，N F-κB表達(dá)明顯減弱，其下游炎癥相關(guān)因子I L-6水平亦顯著降低。結(jié)合本課題組以往研究［8］，認(rèn)為復(fù)方中藥K S P(同活血利濕方)正是通過(guò)N F-κB信號(hào)通路，下調(diào)M C P-1、I L-6的表達(dá)，達(dá)到抑制酒精性腎損害的目的。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，酒辛而溫?zé)幔賱t鼓舞氣血，通暢經(jīng)絡(luò)，有助氣機(jī)，多則釀濕生痰，久而導(dǎo)致氣滯血瘀。濕瘀互結(jié)，久羈體內(nèi)，必傷氣血，變證百出，表現(xiàn)為正虛(氣、血)邪實(shí)(瘀、濕)之病機(jī)。K S P方中黃芪、當(dāng)歸、枸杞益氣養(yǎng)血；當(dāng)歸、紅花活血化瘀，連翹、白茅根、薏苡仁清利濕熱，合奏扶正祛邪之功。國(guó)內(nèi)研究證實(shí)，黃芪、當(dāng)歸等補(bǔ)益藥為主組成的復(fù)方以及化瘀解毒類中藥復(fù)方具有明顯的抗腎纖維化作用［9-11］。本研究結(jié)果提示，K S P在減輕酒精造成的腎臟病理?yè)p害的同時(shí)［2］，可通過(guò)N F-κB、I L-6等靶點(diǎn)而發(fā)揮干預(yù)酒精性腎損害的作用，顯示出良好的抗酒精性腎纖維化潛能。

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Effectsof KangShen Prescription on the NF-κB Activation and IL-6 Level in Ratsw ith Alcoholic RenalDam age

HU Xiaoqin1,QIU Hao1△,LYU Xiaoyun2,LIUWen1,LIYanfen1,TENG Yulian2,TAO Xiaohong1
1 The Second People′s Hospital of Gansu Province,Lanzhou 730000,China; 2 Lanzhou University

Objective:To study the effectof KangShen prescription(KSP)on the activation of nuclear factor kappa-B (NF-κB)and the levelof Interleukin 6(IL-6)in ratsofalcoholic renaldamage.Methods:The66male SD ratswere randomized into normal,alcoholic and Chinesemedicalgroupsw ith 22 cases in each.The normal salines were given to the ratsof normalgroup by gavage,the ethanol for tw ice a day to the ratsof alcoholic group and KSP based on the ethanolequal to the amountof the alcoholic group to the rats of Chinesemedicalgroup for tw ice day, w ith 12 weeks course.At the end of 4th,8th and 12th week,the NF-κB activation and IL-6 levelswere determined by immunohistochemical and ELISA methods.Results:Compared w ith the normal group,the activation of NF-κB and the level of IL-6 in rats renal tissues of alcoholic group significantly wentup(P＜0.05);those in the Chinese medicalgroup weremarkedly lower than in thealcoholic group(P＜0.05).Conclusion:KSP intervention for patients w ith alcoholic kidney damagemay be relevant to its functions in inhibiting the activation of NF-κB and decreasing the levelof IL-6.

alcoholic renaldamage;Chinesemedicine;KSP;NF-κB;IL-6

R965

A

1004-6852(2015)03-0011-03

2014-01-30

2011年甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)1007RJZA085)

胡曉琴(1968—)，女，主治醫(yī)師。研究方向：兒童腎病的診治。

△通訊作者：邱皓(1966—)，男，主任醫(yī)師。研究方向：腎內(nèi)科疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。