張冰睿

(山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南250014)

通心絡(luò)膠囊對(duì)心肌缺血大鼠血管新生功能的影響

張冰睿

(山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南250014)

目的觀察通心絡(luò)膠囊對(duì)心肌缺血大鼠血管新生功能的影響并探討其作用機(jī)制。方法60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、通心絡(luò)低劑量組、通心絡(luò)高劑量組、bFGF陽(yáng)性藥對(duì)照組，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制作大鼠心肌缺血模型，組織植塊法培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)，觀察在血管生成過(guò)程中通心絡(luò)膠囊及各對(duì)照組含藥血清對(duì)CMECs“增殖”、“遷移”和“成管”不同環(huán)節(jié)的干預(yù)作用。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real－time PCR)檢測(cè)各組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的表達(dá)水平。結(jié)果各藥物組干預(yù)后，CMECs的增殖率、遷移率、成管率呈現(xiàn)出正常組＞bFGF組＞通心絡(luò)高劑量組＞通心絡(luò)低劑量組＞模型組的趨勢(shì)，通心絡(luò)高劑量組對(duì)血管生成的不同環(huán)節(jié)均有明顯促進(jìn)作用并顯著優(yōu)于其他各組(P＜0.01)，與bFGF組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。通心絡(luò)高劑量組CMECs中VEGF、bFGF表達(dá)上調(diào)，其中VEGF表達(dá)水平顯著高于模型組和低劑量組(P＜0.01)。結(jié)論通心絡(luò)膠囊能夠促進(jìn)缺血CMECs“增殖”、“遷移”和“成管”，發(fā)揮自身血管搭橋的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)VEGF、bFGF表達(dá)有關(guān)。

通心絡(luò)膠囊;心肌缺血;血管新生

冠心病(Coronary Artery Heart Disease，CHD)心肌缺血和心肌梗死是臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病。WHO統(tǒng)計(jì)表明，CHD是當(dāng)前最常見(jiàn)的死因，嚴(yán)重威脅人類健康。尋找心肌缺血后血運(yùn)重建的方法改善心肌供血，建立側(cè)支循環(huán)、促進(jìn)血管新生是保護(hù)缺血心肌的重要策略［1］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣虛血瘀是心肌缺血和心肌梗死的基本病機(jī)，益氣活血法己成為其主要治則。通心絡(luò)膠囊是基于中醫(yī)絡(luò)病理論為指導(dǎo)研制而成的中藥復(fù)方制劑，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善血管內(nèi)皮功能等作用，臨床上用于治療冠心病取得了良好效果。其保護(hù)心肌的作用可能與促進(jìn)缺血心肌血管新生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠心肌缺血模型，觀察通心絡(luò)膠囊對(duì)缺血心肌血管新生功能及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的影響，探討其對(duì)冠心病心肌缺血血管生成的作用并探討其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，體重210～260 g，購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(魯) 2011－0003，每日給予標(biāo)準(zhǔn)鼠料、水喂養(yǎng)不限。

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Heraeus公司)，倒置相差顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)BIO－TEK公司)，低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)，心電圖機(jī)(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀7300型(美國(guó)Applied biosystems公司)，小動(dòng)物呼吸機(jī)(美國(guó)BIRD制造公司)，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.3 主要試劑

噻唑藍(lán)(MTT，北京Solarbio公司)，二甲基亞楓(DMSO，美國(guó)Amresco公司)，Trizol(美國(guó)Invirotrogen公司)，TIANScript RT KIT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技公司)，SYBR Premix Ex TaqTM realtime－PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 心肌缺血模型制作參照Drexler等方法［2－4］，采用結(jié)扎法制作心肌缺血模型。術(shù)前12 h給動(dòng)物禁食，稱重，3%戊巴比妥鈉0.1 ml/100 mg腹腔注射麻醉，固定記錄心電圖。備皮并消毒，頸部正中暴露并切開(kāi)氣管，待打開(kāi)胸腔時(shí)連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，按潮氣量1～1.5 ml/100 g，頻率80～90次/ min給予呼氣末持續(xù)正壓呼吸，呼吸比率為2－2.5∶1，依據(jù)呼吸深度和頻率進(jìn)行參數(shù)調(diào)整。胸部正中左側(cè)0.5 cm處作長(zhǎng)約2 cm縱向切口，放置開(kāi)瞼器暴露心臟。在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界下約2 mm處用無(wú)創(chuàng)縫線結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支，記錄心電圖出現(xiàn)Q波、T波高聳或倒置、ST段抬高［5］，證實(shí)結(jié)扎成功。觀察大鼠呼吸平穩(wěn)，縫合氣管，術(shù)后24 h存活即為模型制作成功。

1.4.2 分組和給藥共分為5組，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組:模型組(M組)、通心絡(luò)低劑量組(L組)、通心絡(luò)高劑量組(H組)、bFGF陽(yáng)性藥對(duì)照組(P組)，每組12只。另外，未做手術(shù)的12只大鼠作為正常對(duì)照組(N組)。L組和H組分別用通心絡(luò)膠囊0.41 g kg－1d－1、0.82 g kg－1d－1(分別按成人用量的8倍、16倍計(jì)算)加生理鹽水共4 ml灌胃，每天1次［6］。P組于開(kāi)胸結(jié)扎成功后，立即選擇結(jié)扎處及其下部2點(diǎn)，行心肌內(nèi)注射重組bFGF蛋白，每點(diǎn)用量為10 ul(10 ug)。N組和M組每天單用生理鹽水灌胃1次，每次4 ml。共灌胃2周，期間各組飲水、飼料不限。2周后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.3 大鼠CMECs培養(yǎng)和鑒定組織植塊法［7，8］。干預(yù)2周后選取各組大鼠，稱重，3%戊巴比妥鈉0.1 ml/100 mg腹腔注射麻醉，75%乙醇消毒浸泡5 min。開(kāi)胸剪下心臟，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，去除大血管、左右心房、右心室、室間隔，PBS反復(fù)沖洗，將余下的心室肌轉(zhuǎn)移至小燒杯中，眼科剪剪碎約2 mm3的組織塊。將組織塊均勻接種于滴加1 ml胎牛血清的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，直到細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Ⅷ因子蛋白表達(dá)鑒定微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1.4.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖收獲各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CMECs消化重懸，制成單細(xì)胞懸液，按每孔3×104個(gè)接種于24孔培養(yǎng)板中。24 h后分別加入空白血清、通心絡(luò)低劑量血清、通心絡(luò)高劑量血清、bFGF血清繼續(xù)培養(yǎng)3天。加入噻唑藍(lán)溶液(5 g/L) 20 l，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 l DMSO，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，計(jì)算增殖率［9，10］。

1.4.5 劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，將各組細(xì)胞消化，分別加入含有空白血清、通心絡(luò)低劑量血清、通心絡(luò)高劑量血清、bFGF血清的DMEM培養(yǎng)液，接種于24孔板，用滅菌10 μl槍頭在24孔板底部中間劃出一個(gè)“十”字形，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，計(jì)算遷移率［11］。

1.4.6 管腔結(jié)構(gòu)的形成倒置相差顯微鏡觀察CMECs管腔結(jié)構(gòu)的形成，計(jì)數(shù)成管情況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，將各組細(xì)胞消化分別加入含有空白血清、通心絡(luò)低劑量血清、通心絡(luò)高劑量血清、bFGF血清的DMEM培養(yǎng)液接種于6孔板，于倒置相差顯微鏡下(100×)觀察細(xì)胞成管情況，以內(nèi)皮細(xì)胞連接呈“C”形即算一個(gè)管腔。每孔取3處管腔密集的視野，在放大(100×)的視野計(jì)數(shù)管腔數(shù)。每組隨機(jī)獲取10個(gè)圖像，取平均值，計(jì)算成管率。

1.4.7 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real－time PCR)分別取各組細(xì)胞按照Trizol途徑提取總RNA，紫外測(cè)總RNA的純度及濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;內(nèi)參照β－action基因，每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，real－time PCR按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作;反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30S，1個(gè)循環(huán)，95℃5S、60℃31S，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，95℃15S、60℃1min、95℃15S，進(jìn)行產(chǎn)物溶解，并繪制溶解曲線。計(jì)算各樣本的△Ct值(目的基因Ct值—內(nèi)參基因Ct值)，各樣本的相對(duì)定量為2—△Ct，組間表達(dá)差異用2—△△Ct(△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組—△Ct對(duì)照組)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用方差分析或多組設(shè)計(jì)(完全隨機(jī)設(shè)計(jì))的秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組CMECs增殖率、遷移率、成管率比較各組藥物干預(yù)后，CMECs的增殖率、遷移率、成管率均呈現(xiàn)出正常組＞bFGF組＞通心絡(luò)高劑量組＞通心絡(luò)低劑量組＞模型組的趨勢(shì)，與正常組比較其他各組均明顯降低(P＜0.01)，bFGF組、通心絡(luò)高劑量組、通心絡(luò)低劑量組分別與模型組比較，均有顯著差異(P＜0.05～0.01)，表明bFGF、通心絡(luò)高劑量、通心絡(luò)低劑量均有促進(jìn)CMECs增殖、遷移、成管的作用，而bFGF組、通心絡(luò)高劑量組與通心絡(luò)低劑量組比較均有顯著差異(P＜0.01)，bFGF組雖較通心絡(luò)高劑量組檢測(cè)值略高，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)見(jiàn)表1。

表1 各組CMECs增殖率、遷移率、成管率比較

2.2 real－time PCR檢測(cè)VEGF、bFGF的表達(dá)情況real－time PCR結(jié)果顯示，與正常組比較模型組VEGF、bFGF的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.01)，與模型組比較，bFGF組、通心絡(luò)高劑量組均能明顯上調(diào)VEGF、bFGF的表達(dá)水平(P＜0.01，P＜0.05)，通心絡(luò)高劑量組CMECs中VEGF、bFGF表達(dá)上調(diào)，其中VEGF表達(dá)水平顯著高于其他各組(P＜0.01)，與bFGF組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)見(jiàn)表2。

表2 各組CMECs中VEGF、bFGF的mRNA表達(dá)情況

3 討論

心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells，CMECs)是心臟微血管的基本構(gòu)成單位，是正常心肌組織中數(shù)目最多的細(xì)胞，CMECs不僅可以調(diào)節(jié)微血管管腔直徑以控制組織血流量，而且還能夠通過(guò)旁分泌和自分泌功能，在心肌生長(zhǎng)發(fā)育，組織代謝，收縮功能以及節(jié)律控制方面發(fā)揮重要作用。微血管的生成主要涉及①內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的激活;②血管內(nèi)皮基底膜降解，細(xì)胞外基質(zhì)消化重吸收;③內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖和遷移，通過(guò)不斷伸展，彼此相連形成中空的管腔;④周細(xì)胞沿內(nèi)皮移行，在二者聯(lián)合作用下產(chǎn)生新的基底膜這4個(gè)階段。血管內(nèi)皮細(xì)胞通常是長(zhǎng)期靜止存在的，只有在適當(dāng)?shù)拇碳せ罨蟛艜?huì)形成毛細(xì)血管［12－14］。發(fā)生缺血性心臟病時(shí)，機(jī)體內(nèi)源性側(cè)支循環(huán)的代償是很有限的，即血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生能力是很有限的，如何有效建立側(cè)支循環(huán)、促進(jìn)血管新生成為保護(hù)缺血心肌的重要策略。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性心臟病的基本病機(jī)為氣虛血瘀，益氣活血己成為研究的主要方向。關(guān)于益氣活血“生脈”、“生肌”等方面的理論歷代文獻(xiàn)著作已有諸多論述，與血管生成密切相關(guān)。我們的研究結(jié)果，各藥物組干預(yù)后，CMECs的增殖率、遷移率、成管率呈現(xiàn)出正常組＞bFGF組＞通心絡(luò)高劑量組＞通心絡(luò)低劑量組＞模型組的趨勢(shì)，通心絡(luò)高劑量組對(duì)血管生成的不同環(huán)節(jié)均有明顯促進(jìn)作用并顯著優(yōu)于其他各組(P＜0.01)，與bFGF組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。通心絡(luò)高劑量組CMECs中VEGF、bFGF表達(dá)上調(diào)，其中VEGF表達(dá)水平顯著高于模型組和低劑量組(P＜0.01)。表明通心絡(luò)膠囊能夠促進(jìn)缺血CMECs“增殖”、“遷移”和“成管”，發(fā)揮自身血管搭橋的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)VEGF、bFGF表達(dá)有關(guān)。

鑒于中藥或有效成分具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多層次的作用特點(diǎn)，而且中藥復(fù)方在配伍后的作用較為復(fù)雜，深入探討通心絡(luò)膠囊促進(jìn)缺血心肌血管生成的作用機(jī)制研究:一是選擇符合中醫(yī)證型的動(dòng)物模型，最好是豬的模型，其血液循環(huán)與人類更加類似。二是基于中醫(yī)陰陽(yáng)理論，血管生成的機(jī)制應(yīng)考慮到血管生長(zhǎng)因子和抑制因子兩個(gè)相互對(duì)立的方面，并在基因水平上進(jìn)行闡明，為通心絡(luò)膠囊對(duì)缺血心肌的促血管生成作用提供系統(tǒng)的科學(xué)依據(jù)。

［1］Syed IS，Sanborn TA，Rosengart TK.Therapeutic angiogenesis:a biologic bypass［J］.Cardiology，2004，101(1－3):131－143.

［2］陳可冀，寥家禎，肖鎮(zhèn)祥.心腦血管疾病研究［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982，318.

［3］Drexler H，DePenbusch JW，Truog AG，et al．Effeets of diltiazem on cardiac function andregional blood at rest and during exercise in a conseious rat preparation of chronic heart failure(myocardial infarction)［J］．Circulation，1985，71:1260－1272.

［4］范英昌，趙桂峰，張文治.丹酚酸B對(duì)大鼠心肌梗死過(guò)程中病理形態(tài)學(xué)的影響［J］.天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，23(1):12－14.

［5］劉艷偉，劉水平，成建定，等.大鼠心肌缺血再灌注模型的改進(jìn)及心電圖判斷指標(biāo)［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2007，22(7):525－527.

［6］郝光榮.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，1999: 183－184.

［7］馮兵，何作云，王德文，等.心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性的初步觀察［J］.微循環(huán)學(xué)，2000，10(3):19－21.

［8］Chen SF，F(xiàn)ei X，Li SH.A new simple method for isolation of microvascular endothelial cells avoiding both chemical and mechanical injuries［J］.Microvascular Research，1995，50(1):119－128.

［9］趙嘉惠，張華屏，王春芳.MTT法在檢測(cè)細(xì)胞增殖方面的探討［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(3):262－263.

［10］孟慶楠，張皓楠，王益民，等.MTT法檢測(cè)銀杏葉注射液對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30(1):36－37.

［11］Cai WJ，Wang MJ，Moore PK，et al.The novel proangiogenic effect of hydrogen sulfide is dependent on Akt phosphorylation［J］.Cardiovasc Res，2007，76(1):29－40.

［12］唐標(biāo)，曹蘇，康煥菊，等.大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)［J］.江蘇醫(yī)藥，2010，36:941－942．

［13］龔敏，李樹(shù)清.體外培養(yǎng)細(xì)胞缺氧模型及特點(diǎn)［J］.臨床合理用藥，2011，4:157－158.

［14］Choi D W，Maulucci G M，Kriegstein A R，et al.Glutamate neurotoxicity in cortical cell cuhure［J］.J Neurosci，1987，7:357－368.

The effects of Tongxinluo capsule on the angiogenesis in rats of myocardial ischemia

ZHANG Bing－xin
(Shandong university of Chinese medicine basic medical school，Jinan 250014，China)

Objective:To investigate the effects of Tongxinluo capsule on the angiogenesis in rats of myocardial ischemia and its mechanisms.Methods:60 SD rats were divided into normal group，model group，low－dose group of Tongxinluo capsule，high－dose of group of Tongxinluo capsule and bFGF positive control group.We made the rat model of myocardial ischemia by ligate the anterior descending branch of coronary artery and culture the microvascular endothelial cells (CMECs)of myocardial muscles by explant method.We observe the intervention effects of Tongxinluo capsule and the control medicated serums on proliferation，migration，angioblast of CMECs.Real－time PCR was used to detect the expression level of VEGF，bFGF in different groups.Results:After the drug intervention，the tendency of proliferation rate，migration rate and angioblast rate of CMECs from high to low were normal group，bFGF positive control group，high－dose of group of Tongxinluo capsule，low－dose group of Tongxinluo capsule，model group consequently.High－dose of Tongxinluo capsule could facilitate the angiogenesis in different aspects and better than other groups(p＜0.01).Compared to the bFGF group，there was no statistically significance(P＞0.05.The levels of VEGF and bFGF were upregulated of CMECs in group of high－dose Tongxinluo capsule.The expression levels of VEGF were higher than the model group and the low－dose Tongxinluo capsule group(P＜0.01).Conclusion:Tongxinluo capsule could facilitate the proliferation，migration and angioblast in ischemic CMECs.It might have the effect of vascular bypass which might related to the upregulation of MEGF and bFGF.

tongxinluo capsule;myocardial ischemia;angiogenesis

R543

:A

:7115-1004(2015)06-0636-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.06.012

2015－3－15)

張冰睿(1991—)，女，山東泰安人，山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2011級(jí)。