何鳳蘭，譚梅英

(1.佛山市中醫(yī)院三水醫(yī)院，廣東佛山528100；2.廣東省第二中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510095)

中心復(fù)合設(shè)計(jì)法優(yōu)化半枝蓮多糖提取工藝

何鳳蘭1，譚梅英2

(1.佛山市中醫(yī)院三水醫(yī)院，廣東佛山528100；2.廣東省第二中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510095)

目的 采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)法優(yōu)化半枝蓮中多糖的提取工藝。方法 采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)，以加水倍量、提取溫度和提取時(shí)間為考察因素，以多糖提取率為考察指標(biāo)，對(duì)半枝蓮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 所建立的二次多項(xiàng)式回歸模型具有良好的預(yù)測(cè)性，回歸方程P<0.01，回歸系數(shù)r2=0.9743，失擬項(xiàng)P>0.05，優(yōu)選的最佳提取工藝為加34.47倍量水，提取2次，每次2.68 h，提取溫度98.02℃。結(jié)論 優(yōu)選的提取工藝合理、穩(wěn)定、可行。

半枝蓮；多糖；中心復(fù)合設(shè)計(jì)法；提取工藝

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbateD.Don的干燥全草[1]。一般在夏季或者秋季莖葉茂盛的時(shí)候采挖，用水洗凈后曬干即可?，F(xiàn)代研究表明[2-4]，半枝蓮具有抗病毒、抗癌、保肝、消腫、止痛等功效。半枝蓮含有黃酮、多糖、生物堿等成分，其中多糖是重要的抗腫瘤活性成分[2，5-7]。本實(shí)驗(yàn)采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)法對(duì)半枝蓮多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 資料與方法

1.1 儀器與材料

UV-7504型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司)，CP224C型電子分析天平(奧豪斯-上海儀器有限公司)，HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

半枝蓮藥材購(gòu)自廣州致信中藥飲片有限公司(批號(hào)：20140205)，經(jīng)鑒定為唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbate D.Don的干燥全草。無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)110833-201205，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院)，乙醚、無(wú)水乙醇、苯酚、硫酸均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取于105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院)52.15 mg，加水100 ml溶解，制成每1 ml含無(wú)水葡萄糖0.5215 mg的溶液。精密量取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5 ml、3.0 ml，分別置10 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液1 ml，置具塞試管中，分別加5%苯酚溶液2.0 ml，混勻，迅速加入硫酸7.0 ml，搖勻，室溫放置30分鐘，取出，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法(《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅤA)，在490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=52.581C+0.015(A為吸光度，C為濃度)，r=0.9994，結(jié)果表明無(wú)水葡萄糖在0.005215～0.015645 mg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

1.2.2 半枝蓮多糖的測(cè)定 取半枝蓮藥材粉末10 g，精密稱定，加乙醚100 ml，索氏回流提取至提取液無(wú)色，取藥渣揮干溶劑，按照表1的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇不同加水倍量、提取溫度和提取時(shí)間，采用回流提取法，提取兩次，合并水提液，適當(dāng)濃縮，加無(wú)水乙醇使含醇量達(dá)80%，進(jìn)行沉淀，所得沉淀物加100ml蒸餾水使溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液。精密量取續(xù)濾液0.5 ml，加水稀釋至10 ml，取1 ml按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.2.3 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用回流提取法，確定提取次數(shù)為兩次，選擇加水倍量、提取溫度和提取時(shí)間為考察因素，以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2 結(jié)果

中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表1。采用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到加水倍量(X1)、提取溫度(X2)和提取時(shí)間(X3)與多糖提取率(Y)之間的二次多項(xiàng)式回歸方程，結(jié)果如下：

Y=-16.84869+0.082708A+0.34914B+0.82135C+1.3750×10-4AB-1.8750×10-3AC+8.7500×10-4BC-1.32229×10-3A2-1.81727×10-3B2-0.15698C2

由表2可見(jiàn)，回歸方程P<0.01，回歸系數(shù)r2=0.9743，失擬項(xiàng)P>0.05，說(shuō)明所得方程的擬合情況良好。

表1 半枝蓮多糖提取工藝設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 二次回歸方程方差分析

注：*P<0.05顯著性差異；**P<0.01極顯著性差異。

3 最優(yōu)工藝的確立及驗(yàn)證

根據(jù)二次多項(xiàng)式回歸方程，使用Design-Expert軟件繪制因變量(Y)與各自變量(X1、X2、X3)之間的3D效應(yīng)曲面圖及等高線圖(圖1～6)，得出最佳提取工藝條件：加34.47倍量水，提取2次，每次2.68h，提取溫度98.02℃，此時(shí)多糖理論提取率為2.7884%。對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果多糖平均提取率為2.7302%，RSD為1.73%(n=5)。表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。

圖1 考察因素A與考察因素B對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)Y的等高線圖

圖2 考察因素A與考察因素B對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)Y的3D響應(yīng)面圖

圖3 考察因素A與考察因素C對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)Y的等高線圖

圖4 考察因素A與考察因素C對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)Y的3D響應(yīng)面圖

圖5 考察因素B與考察因素C對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)Y的等高線圖

圖6 考察因素B與考察因素C對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)Y的3D響應(yīng)面圖

4 討論

多糖類成分在植物界中分布廣泛，是中藥的有效活性成分之一。半枝蓮多糖具有抗腫瘤、降血糖的作用。目前，對(duì)半枝蓮多糖提取工藝的研究多采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)法，試驗(yàn)次數(shù)雖少，但精度不高，預(yù)測(cè)性較差。而中心復(fù)合設(shè)計(jì)法采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以提高實(shí)驗(yàn)精度，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值。

采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)法，對(duì)半枝蓮多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用回流提取法，確定提取次數(shù)為兩次，選擇加水倍量、提取溫度和提取時(shí)間為考察因素，最終確定其最佳提取條件為：加34.47倍量水，提取2次，每次2.68h，提取溫度98.02℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較吻合，相對(duì)偏差較小，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。本實(shí)驗(yàn)為中心復(fù)合設(shè)計(jì)法應(yīng)用于中藥提取工藝的優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：109.

[2]蔣小崗，顧振綸.半枝蓮的化學(xué)成分和藥理作用[J].中國(guó)野生植物資源，2004，23(1)：3-5.

[3]馬紅櫻，張德祿，胡春香，等.植物活性多糖的研究進(jìn)展[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，40(3)：112-117.

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[6]張自麗，宋高臣.半枝蓮多糖的提純及抑瘤作用的研究進(jìn)展[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32(6)：44-45.

[7]楊穎，李汾.百合中性多糖對(duì)5-FU增效減毒作用及其對(duì)體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[J].延安大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2013，11(2)：8-11.

Optimization of extraction technology for polysaccharide inScutellariaebarbataeby central composite design-response surface method

HEFeng-lan1，TANMei-ying2

(1.Sanshui hospital Foshan City Hospital of traditional Chinese Medicine,Foshan 528100,China;2.The second hospital of Guangdong province of Phaimacy department,Guangzhou 510095,China)

Objective To optimize extracting technology of polysaccharide inScutellariaebarbataeby central composite design-response surface method.Methods Taking the amount of water, extraction temperature and extraction time as factors,extraction rate of polysaccharide as index,extraction process of Scutellariae Barbatae Herba was optimized by CCD-RSM.Results The regression model has good predictability (r2=0.9743),with regression equationP<0.01 and lack of fitP>0.05.Optimum condition of extraction technology was extracted 2 times with 34.47-fold water,98.02℃ temperature,and 2.68 hours each time.Conclusion Optimum extraction process was reasonable,stable and feasible.

Scutellariaebarbatae; Polysaccharide; Central composite design-response surface method; extraction technology

何鳳蘭(1975—)，女，廣東佛山人，佛山市中醫(yī)院三水醫(yī)院主管中藥師。

R284.2

A

1672-2639(2015)02-0007-04

2014-09-15；責(zé)任編輯 徐文梅]