馬克君，施星臣，李 平，李曉強，任 雯，秦 龍，施鑫鶴

（1.蘭州大學第二醫(yī)院中心實驗室，甘肅蘭州 730030；2.蘭州市第二人民醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730030；3.蘭州大學第二醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州 730030）

◇基礎研究◇

sh-Set7/9表達載體的構建及其在HepG2細胞中的功能

馬克君1，施星臣2，李 平1，李曉強3，任 雯1，秦 龍3，施鑫鶴1

（1.蘭州大學第二醫(yī)院中心實驗室，甘肅蘭州 730030；2.蘭州市第二人民醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730030；3.蘭州大學第二醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州 730030）

目的構建sh-Set7/9表達載體并篩選穩(wěn)定轉染HepG2細胞株，考察其干擾效果，為后續(xù)研究Set7/9基因的功能及其在肝癌細胞系中的作用提供實驗基礎。方法尋找靶向序列，設計siRNA片段，構建針對人Set7/9基因的sh RNA和對照載體，將干擾載體和載體穩(wěn)定轉染肝癌細胞HepG2，Real-time PCR檢測細胞中Set7/9基因的表達水平；同時利用Western blot方法在蛋白質水平進行檢測，確定該基因的干擾效果。結果成功構建載體Set7/9-sh RNA；Real-time PCR結果顯示該基因表達水平明顯被抑制（P＜0.05），同樣Western blot檢測表明其蛋白表達也顯著下調。此外，與其相關的Sirt1蛋白表達水平提高8.4倍，Suv39h1蛋白表達水平升高1.1倍。結論構建穩(wěn)定轉染株后，可以顯著下調Set7/9基因的表達，同時影響與其相關的Sirt1和Suv39h1蛋白表達水平，提示對肝癌HepG2細胞活性產(chǎn)生影響。

Set7/9；Hep G2細胞；Western blot；甲基轉移酶；載體構建；肝癌

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉移性肝癌兩種，在我國居惡性腫瘤死亡率第2位，嚴重危害群眾的身體健康［1-2］。因此，對其形成機制的研究報道較多。隨著表觀遺傳學的發(fā)展，從相關的甲基轉移酶的角度對其成因和干預的研究也常有報道，但其中的具體關系和機制尚有待深入研究。

越來越多的研究涉及蛋白甲基轉移酶Set7/ 9［3-4］，它含有SET結構域，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM/Ado Met）為底物，是蛋白賴氨酸甲基化轉移酶（protein lysine methyltransferases，PLMTs或PKMTs）家族成員［5-6］。有研究表明，Set7/9介導Suv39h1甲基化，導致了異染色質松散和基因組不穩(wěn)定［7］；還可以影響Sirtuin 1（Sirt1）去乙?；饔茫?］。Suv39h1與白血病、胃癌等一些癌癥的發(fā)生發(fā)展相關。而對于Set7/9在肝癌細胞中是否能調控其細胞活性、細胞周期的變化，以及如何影響Sirt1和Suv39h1蛋白的表達和功能的實現(xiàn)仍有待研究。

本研究以人Hep G2細胞株為靶細胞，構建了Set7/9-shRNA質粒，通過慢病毒包裝，轉染到HepG2細胞系中，并篩選到Set7/9沉默的穩(wěn)定細胞株HepG2，用以研究在肝癌細胞系HepG2中該基因的功能，并初步探索與其相關的基因Sirt1和Suv39h1的表達變化情況，從而為進一步闡釋Set7/ 9、Sirt1和Suv39h1在肝癌細胞中的功能及其對肝癌細胞活性及細胞周期的影響提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑和儀器肝癌細胞株HepG2、大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞由本實驗室保存；質粒抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；DNA內切酶（Bam HⅠ、Eco RⅠ）、DNA連接酶、DNA marker購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖購自加拿大BBI公司；DMEM、胎牛血清FBS、雙抗（青鏈霉素）均購自GIBCO公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自Invitrogen公司；Polybrene購自Sigma公司；PBS購自AMEROSCO公司；SET7/9的單克隆抗體SET7/9（sc-56774）、Sirt1的多克隆抗體Sirt1（sc-15404）、Suv39h1的單克隆抗體Suv39h1（sc-377112）購自Santa Cruz公司；生物安全柜購自上海上凈凈化設備有限公司；熒光顯微鏡購自Motic公司；MX3000P實時熒光定量PCR儀購自Stratagene公司。

1.2 SETD7-shRNA載體質粒的構建和鑒定將SET7/9 mRNA序列輸入在線軟件http：//genomics.jp/sidirect/，根據(jù)文獻報道，SET7/9基因設計的干擾序列為GGGCACCTGGACGATGACGGA，陰性對照選擇無意序列TTCTCCGAACGTGTCACGT。LV3-shRNA模板中的loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號。兩端添加Bam HⅠ與Eco RⅠ酶切位點。將DNA oligo分別用TE（p H 8.0）溶解，濃度為100μmol/L。在PCR儀上按照如下程序進行退火處理：95℃、5 min；85℃、5 min；75℃、5 min；70℃、5 min；4℃保存。退火處理后得到濃度為10μmol/L的sh RNA模板。將所得模板溶液稀釋50倍，終濃度為200 nmol/L，用于連接反應。用Bam HⅠ與Eco RⅠ酶切載體，瓊脂糖電泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0回收。之后進行連接反應，將連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)的Top10菌種中，挑選陽性克隆，抽提質粒，單酶切再測序鑒定。

1.3 慢病毒包裝取細胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293FT細胞，細胞計數(shù)后，按照每個10 cm的培養(yǎng)皿5×106個細胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中，37℃、50 m L/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；次日加入5 m L新鮮的含100 mL/L血清DMEM培養(yǎng)液，DNA-Lipofectamine 2000復合物共轉染293FT細胞，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復合物。放置37℃、50 m L/L CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；轉染后48 h收集培養(yǎng)上清進行濃縮；加入10 mL新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉染后72 h再次收集濃縮，測定滴度；分裝好的病毒放置-80℃保存。

1.4 重組慢病毒感染HepG2Hep G2在6 cm dish中培養(yǎng)至80%～90%融合時，傾去培養(yǎng)液，用3 mL D-Hank’s液洗滌細胞2次。加1 m L Trypsin-EDTA液，混勻后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3 min。再加入2 m L DMEM培養(yǎng)液，吹打使細胞形成單細胞懸液。血球計數(shù)板計數(shù)，按10×105細胞/孔的密度接種于6孔板，混勻后37℃、50 m L/L CO2培養(yǎng)24 h。將慢病毒原液200μL，用100 m L/L FBS的DMEM培液5倍稀釋，并加入終濃度為0.5μg/m L的Polybrene。吸去6孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入上述1 mL稀釋的病毒液，同時設立空白對照組，于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)24 h。吸棄6孔板中的稀釋病毒液，每孔加入2 mL 100 mL/L FBS的DMEM培液于37℃、50 mL/L CO2繼續(xù)培養(yǎng)至72、96 h分別收樣。

1.5 SET7/9基因和蛋白表達效果的檢測用puromycin進行選擇，獲得穩(wěn)篩株，并擴增穩(wěn)篩株細胞，分別收樣，用于提取細胞總RNA，進行熒光定量PCR實驗。GAPDH（內參）F primer：CATGAGAAGTATGACAACAGCCT，R primer：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT；SET7/9（目的）F primer：CACAGATGGGAGACTGATCTTCAAG，R primer：TTACTTCTCCTACAAGGCTTCCTCC。實驗擴增條件為：95℃、3 min預變性；95℃、30 s；62℃、40 s；40循環(huán)；Western blot檢測干擾后SET7/9蛋白的表達情況。

1.6 統(tǒng)計學處理應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以表示。進行方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗。兩組以上的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Set7/9-sh RNA載體質粒的鑒定和測序結果將p GLV3/H1/GFP/puro空載體進行酶切，回收，與插入子連接，轉化Top10細菌株，挑取4個菌落抽提質粒。所得質粒用Eco RⅠ進行單酶切鑒定，電泳后可以看到約8 000 bp的線性載體，挑取1、3號克隆進行測序，證明SET7/9sh RNA載體構建成功（圖1）。

圖1 pGLV3/H1/GFP/puro-Set7/9質粒克隆的鑒定Fig.1 Identification ofplasmid pGLV3/H1/GFP/puro-Set7/9

2.2 慢病毒載體的包裝及侵染細胞提取質粒，將慢病毒包裝系統(tǒng)質粒共轉染293FT細胞，48 h后收集培養(yǎng)上清進行濃縮；轉染后72 h再次收集濃縮。測定滴度為1×108TU/m L，重組后的病毒侵染HepG2細胞，并獲得最適puromycin濃度，經(jīng)過培養(yǎng)篩選獲得穩(wěn)篩株細胞（圖2）。

2.3 Real-time PCR及Western blot實驗證實SET7/9基因被沉默通過穩(wěn)篩株細胞擴增，分別收樣，用于Real-time PCR、Western blot檢測。從基因和蛋白水平上對HepG2細胞中SET7/9基因的沉默效果進行檢測，表明該基因表達水平明顯被抑制（P＜0.05）；同樣Western blot檢測顯示，其蛋白表達也顯著下調。以GAPDH和β-actin為內參，檢測轉染72 h后SET7/9基因和蛋白表達情況（表1、圖3）。

圖2 病毒侵染HepG2細胞圖Fig.2 Virus infected Hep G2（×100）

圖3 SET7/9基因沉默后基因和蛋白的相對表達情況Fig.3 Relative expressions of gene and protein after SET7/ 9 knockdown

2.4 SET7/9基因影響Sirt1及Suv39h1的表達在SET7/9基因被成功沉默后，用Western blot實驗分別對Sirt1及Suv39h1的蛋白表達水平進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)Sirt1蛋白表達水平顯著增加8.4倍，Suv39h1蛋白表達水平也有上調1.1倍，但變化不明顯（圖4）。

表1 Real-time PCR檢測基因沉默后SET7/9表達Tab.1 Detection of SET7/9 expression after knockdown detected by Real-time PCR

圖4 Sirt1與Suv39h1蛋白表達水平變化Fig.4 Changes of Sirt1 and Suv39h1 protein expressions

3 討 論

Suv39h1是第1個被發(fā)現(xiàn)的特異性H3K9甲基轉移酶，組蛋白H3K9的甲基化在異染色質形成及基因轉錄調控中具有重要作用。近年的一些研究表明，H3K9甲基化失衡與白血病、胃癌等一些癌癥發(fā)生發(fā)展相關。Set7/9介導Suv39h1甲基化，導致了異染色質松散和基因組不穩(wěn)定。有研究人員確定了蛋白質甲基轉移酶Set7/9是Suv39h1活性的一個獨特調控因子，證實Set7/9介導了Suv39h1賴氨酸105和123位點特異性甲基化［7］。

此外，朱衛(wèi)國等［8］鑒別出Set7/9也是Sirt1的獨特調控因子，細胞內Set7/9與Sirt1相互作用顯著增強，從而抑制了Sirt1與p53的相互作用，導致p53乙?；较鄳龈?，p53介導的轉錄激活增強。研究結果表明除甲基化作用依賴的機制，Set7/9還可通過Sirt1間接調控p53的功能。p53作為抑癌基因，與一些腫瘤的發(fā)生相關，去乙?；谆缺碛^遺傳學修飾對其功能有影響［9-10］。

因此，有必要對Set7/9在肝癌細胞中的功能進行研究。shRNA是多種小分子干擾RNA制備方法中較好的可以進行長期基因沉默研究的方法［11-13］。脂質體介導的sh RNA進入細胞的方法往往轉染效率低，而通過慢病毒包裝進行轉染在基礎研究中得到廣泛應用［14］。慢病毒是在人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的基礎上改造形成的逆轉錄病毒［15］，能夠將目的基因整合到染色體上，得到穩(wěn)定的細胞株。

sh RNA為環(huán)狀結構，在細胞內經(jīng)酶切產(chǎn)生小分子干擾RNA，后者的反義鏈在細胞內與特定蛋白質結合形成RISCs（RNA-induced silencing complexes），通過反義鏈與特異mRNA序列互補結合，剪切mRNA導致mRNA降解，從而在細胞內產(chǎn)生特定基因的沉默效果［16-17］。其具有抑制效果確切、嚴格序列特異性及針對性強等優(yōu)勢。有效干擾序列設計是sh RNA構建的關鍵，本實驗設計的靶序列參考已有文獻報道，并進行sh RNA構建，實驗證明為有效干擾靶點。

總之，本研究立足近年來發(fā)現(xiàn)Set7/9催化的非組蛋白甲基化作用能引起蛋白穩(wěn)定性改變和基因表達變化等多種分子生物學效應，這些分子效應涉及到染色體結構、細胞周期及凋亡等方面，構建了Set7/9-shRNA質粒，研究在肝癌細胞系Hep G2中該基因的功能，并初步探索與其相關的蛋白的表達變化情況。結果顯示，Sirt1蛋白表達水平提高8.4倍，Suv39h1蛋白表達水平升高1.1倍。這兩種蛋白分別具有去乙酰化和甲基化的功能，因此其表達水平的變化暗示在HepG2細胞系中Set7/9基因可能會對其活性和細胞周期等產(chǎn)生影響，這有待更深入的研究。

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（編輯 卓選鵬）

Construction of shSet7/9 vector and its function in HepG2

MA Ke-jun1，SHI Xing-chen2，LI Ping1，LI Xiao-qiang3，REN Wen1，QIN Long3，SHI Xin-he1
（1.Central Laboratory，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030；2.Department of Orthopaedics，Lanzhou Second Hospital，Lanzhou 730030；3.Pharmacy，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China）

ObjectiveTo silence human gene Set7/9 and screen out stable transfection cell line in hepatocellular carcinoma cell line Hep G2 so as to investigate the impact of down-regulation of Set7/9 in cell line HepG2 and provide experimental foundation for studies on the effect of set7/9 in HepG2.MethodsThe target oligo was designed and synthesized；sh RNA interference vector and the control vector were constructed and transfected into Hep G2 cells；the stable transfection cells were screened out.Then Real-time PCR and Western blot were performed to detect the silence of Set7/9 according to both gene expression and protein expression level.ResultsThe sh RNA interference vector was constructed and transfected into Hep G2 cells successfully.Compared with that in the negative control group，the expression of Set7/9 was dramatically downregulated（P＜0.05）. Meanwhile，the expression of related protein Sirt1 and Suv39h1 was upregulated 8.4 folds and 1.1 fold，respectively.ConclusionDownregulation of Set7/9 expression can upregulate Sirt1 and Suv39h1，suggesting that Set7/9 may af fect the activity of Hep G2 cell lines.

Set7/9；Hep G2 cell；Western blot；methyltransferase；vector construction；hepatocellular carcinoma

R735.7

A

10.7652/jdyxb201506008

2015-01-06

2015-05-06

2013年蘭州大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費（No.lzujbky-2013-144）

Supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities（No.lzujbky-2013-144）

施鑫鶴.E-mail：shixh@lzu.edu.cn

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150929.0859.010.html（2015-09-29）