單 濤，鄭 波，陳 熹，吳 濤，季爾麗，白育花，王繼欣，肖小玲

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院：1.普通外科；2.手術(shù)室，陜西西安 710004）

◇臨床研究◇

AQP5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系

單 濤1，鄭 波1，陳 熹1，吳 濤1，季爾麗1，白育花1，王繼欣1，肖小玲2

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院：1.普通外科；2.手術(shù)室，陜西西安 710004）

目的探討水通道蛋白5（AQP5）的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理及預(yù)后關(guān)系。方法收集術(shù)前未予任何治療的臨床病例資料齊全的原發(fā)性結(jié)直腸癌病例45例，采用免疫組化法檢測(cè)AQP5的表達(dá)。比較AQP5表達(dá)與年齡、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤部位、淋巴結(jié)、病理類(lèi)型之間的關(guān)系，并結(jié)合隨訪資料分析AQP5表達(dá)與否和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果45個(gè)腫瘤標(biāo)本中，14例（31.1%）高表達(dá)AQP5，29例（64.4%）中度表達(dá)，2例（4.4%）無(wú)AQP5染色。癌旁和正常組織中AQP5表達(dá)率分別為3例（6.67%）和3例（6.67%）。AQP5的表達(dá)還與TNM分期（P=0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.016）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.000）呈正相關(guān)。在年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)和腫瘤大小中其表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論AQP5可能被用作預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后的良好指標(biāo)。

結(jié)直腸癌；水通道蛋白5（AQP5）；預(yù)后

目前，結(jié)直腸癌仍是腫瘤相關(guān)死亡的第二大常見(jiàn)原因［1］。盡管在診斷和治療中取得一定進(jìn)展，結(jié)直腸癌仍嚴(yán)重影響生命健康［2］。因此，尋找干預(yù)治療的新靶向非常重要。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，腫瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于腫瘤微環(huán)境和腫瘤代謝［3］。水分子在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮顯著的作用，這一認(rèn)識(shí)對(duì)于制訂抗腫瘤治療方案非常重要［4］。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是具有分泌和吸收功能的上皮細(xì)胞運(yùn)輸水的一類(lèi)水膜通道，某些亞型也參與其他分子的運(yùn)輸，如甘油和尿素。目前，在哺乳動(dòng)物中有13種AQP成員，其中，AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6、AQP8主要是水選擇性，而AQP3、AQP7、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12也可以輸送甘油和其他小分子溶質(zhì)［5］。AQPs基于其特定的組織定位在幾種類(lèi)型腫瘤中表達(dá)有所不同，AQP1的表達(dá)通常與腦腫瘤相關(guān)［6］。王璐等［7］研究發(fā)現(xiàn)，AQP3表達(dá)與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的分化程度相關(guān)，在AQP3敲除小鼠的研究中，AQP3基因缺失誘導(dǎo)對(duì)致癌物誘導(dǎo)的皮膚腫瘤的抵抗。通過(guò)AQP3進(jìn)行的甘油轉(zhuǎn)運(yùn)有助于細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生中ATP（adenosine triphosphate）的生成［8］。AQP5可能參與細(xì)胞增殖而廣泛過(guò)表達(dá)于胰腺癌中［9］。

AQP5在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，這表明，AQP5過(guò)表達(dá)在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮一定作用［10］。有資料提出RAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以提高AQP5過(guò)表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞增殖［11］。此外，一項(xiàng)分子研究發(fā)現(xiàn)，AQP5與SH3結(jié)構(gòu)域c-Src蛋白結(jié)合，這一蛋白是與各種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移表型相關(guān)的非受體胞質(zhì)酪氨酸激酶［12］。然而，AQP5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和臨床意義尚未完全闡明。為了評(píng)估AQP5作為結(jié)直腸癌的一種新型預(yù)后標(biāo)志物的潛力，我們使用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)直腸癌臨床樣本中AQP5的表達(dá)，進(jìn)一步分析AQP5的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料選取西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院普外科2012年1月至2013年12月的45例結(jié)直腸癌患（結(jié)腸25例，直腸20例）者的腫瘤組織，40 m L/L的甲醛固定。其中，男性24例，女性21例，手術(shù)時(shí)的中位年齡為58.3歲（40～78歲）。樣本的組織學(xué)類(lèi)型均為結(jié)直腸腺癌，腫瘤分期和組織學(xué)分級(jí)均根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)的分類(lèi)記錄。45例標(biāo)本中，Ⅰ期3例、Ⅱ期11例、Ⅲ期27例、Ⅳ期4例。病理分級(jí)如下：7例Ⅰ級(jí)、20例Ⅱ級(jí)、18例Ⅲ級(jí)。對(duì)所有的患者進(jìn)行隨訪，隨訪中位時(shí)間為23個(gè)月（5～53個(gè)月）。所有的研究均經(jīng)西安交通大學(xué)人體試驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)，受試人員均簽署由中國(guó)西安交通大學(xué)人體試驗(yàn)會(huì)員會(huì)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書(shū)。

1.2 免疫組化檢測(cè)AQP5蛋白的免疫組化采用標(biāo)準(zhǔn)化的鏈霉親和過(guò)氧化物酶的方法，組織切片（4μm）在適當(dāng)濃度的一抗中孵育過(guò)夜，次日，切片在生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG中孵育30 min，隨后在過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育20 min。用0.2 g/L的3，3′-二氨基聯(lián)苯胺在50 mmol/L Tris-HCL緩沖液（p H 7.6）中染色5～7 min，經(jīng)蘇木精復(fù)染、水沖洗、脫水、清除、封片。免疫染色的陰性對(duì)照用非免疫山羊或兔血清替代一抗，顯微鏡觀察，抗AQP5和βactin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物公司。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)使用DA KO Hercept Test評(píng)分方法：（-）無(wú)細(xì)胞染色或少于30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜（質(zhì)）較弱染色；（+）大于30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜（質(zhì)）部分較弱染色；（■）大于30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜（質(zhì)）完全較弱到中等染色；（■）大于30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜完全強(qiáng)染色。（-）和（+）的判為AQP5表達(dá)陰性，而評(píng)分為（■）和（■）的判為AQP5表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用χ2檢驗(yàn)或雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)分析方法。Pearson相關(guān)系數(shù)用來(lái)衡量關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。采用Kaplan-meier計(jì)算生存率、Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。選擇有顯著性的因素逐步建立Cox多元比例風(fēng)險(xiǎn)模型，以確定其預(yù)后價(jià)值。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13（SPSS，Chicago）軟件。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌中AQP5蛋白的表達(dá)為確定AQP5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)狀態(tài)，首先用免疫組化評(píng)估結(jié)直腸癌患者的腫瘤標(biāo)本、癌旁組織和正常組織。研究結(jié)果顯示，AQP5在病例組中14/45（31.1%）強(qiáng)表達(dá)，29/45（64.4%）中度表達(dá)，僅偶爾在癌旁組織［（3/ 45），6.67%］和正常組織［（3/45），6.67%］中檢測(cè)到（圖1）。

2.2 AQP5表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系A(chǔ)QP5蛋白表達(dá)和臨床病理間的關(guān)系總結(jié)如下：AQP5在Ⅰ～Ⅱ期病例［7.1%（1/14）］中強(qiáng)表達(dá)，顯著低于Ⅲ期［33.3%（9/27）］和Ⅳ期［100%（4/4）］中的表達(dá)水平（P=0.002），與淋巴結(jié)（P=0.016）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.000）呈正相關(guān)，與年齡（P=0.848）、性別（P=1.000）、組織學(xué)分級(jí)（P=0.913）和腫瘤大?。≒=0.263）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

圖1 結(jié)直腸癌、癌旁和正常組織中AQP5的表達(dá)水平Fig.1 Expression of AQP5 in colorectal cancer，para-neoplastic and normal tissues（×400）

表1 結(jié)直腸癌組織中AQP5表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 Association between AQP5 expression and clinicopathologic factors in colorectal cancer

2.3 AQP5與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系為了確定AQP5與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系，我們對(duì)基于AQP5表達(dá)狀態(tài)的患者累積生存率進(jìn)行了分析（圖2）。將AQP5弱染色和無(wú)染色定為陰性，強(qiáng)染色定為陽(yáng)性。AQP5陰性患者（n=31）3年累積生存率為24.3%（中位時(shí)間，21.2個(gè)月）；相反地，AQP5陽(yáng)性患者（n=14）的累積生存率為7.4%（中位時(shí)間，7.7個(gè)月），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.011）。

圖2 結(jié)直腸癌組織中AQP5表達(dá)陽(yáng)性組和陰性組的生存曲線圖Fig.2 The postoperative survival curves of colorectal cancer patients with positive or negative AQP5 expression

多因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.018）和TNM分期（P=0.031）是結(jié)直腸癌患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素；腫瘤大小等其他臨床參數(shù)不是獨(dú)立的預(yù)后因素（表2）。

表2 Cox多元比例風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型Tab.2 Prognostic factors in Cox multivariate analyses

3 討 論

AQPs是廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞膜、高效選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異通道。腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素的作用下，細(xì)胞在基因水平上失去其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致新生物生成的過(guò)程。腫瘤所依賴(lài)的各種代謝都需要水分子的參與，而水通道蛋白可以快速特異的轉(zhuǎn)運(yùn)水分子。到目前為止，在哺乳動(dòng)物中有13種AQP成員，其中，AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6、AQP8主要是水選擇性，而AQP3、AQP7、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12也可以輸送甘油和其他小分子溶質(zhì)［5］。它參與腎臟對(duì)水的重吸收、腺體的分泌、小腸脂肪吸收，參與氣血屏障［13］、血腦屏障、腦脊液形成，參與應(yīng)激反應(yīng)、組織損傷、感染及腫瘤形成過(guò)程等。AQPs基于其特定的組織定位在幾種類(lèi)型腫瘤中表達(dá)有所不同，AQP1的表達(dá)通常與腦腫瘤相關(guān)［6］。在AQP3敲除小鼠的研究中，AQP3基因缺失可以誘導(dǎo)致癌物所致的皮膚腫瘤的抵抗。通過(guò)AQP3進(jìn)行的甘油轉(zhuǎn)運(yùn)有助于細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生中ATP的生成［8］。AQP5可能參與細(xì)胞增殖而廣泛過(guò)表達(dá)于胰腺癌中［9］。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織和正常組織相比，結(jié)直腸腫瘤中AQP5表達(dá)上調(diào)。此外，AQP5與高TNM分期和不良預(yù)后密切相關(guān)。顯然，AQP5過(guò)表達(dá)的患者被證實(shí)更易轉(zhuǎn)移。這些研究結(jié)果擴(kuò)展了我們對(duì)AQP5作為診斷指標(biāo)意義的理解。

水通道蛋白在維持水平衡和調(diào)節(jié)多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用［14］。AQP5，21～24ku蛋白，最初被認(rèn)為是位于細(xì)胞膜小窩的主要結(jié)構(gòu)蛋白、參與致癌轉(zhuǎn)化和惡性進(jìn)展的關(guān)鍵分子［15-16］。AQP5促進(jìn)腫瘤進(jìn)展具體作用機(jī)制還不完全明確。有研究認(rèn)為AQP5可能通過(guò)促血管生成機(jī)制起作用［17］：其一，新生血管可以提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣；其二，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌多種多肽生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)［18］AQP1表達(dá)于腫瘤新生血管并且可促進(jìn)腫瘤血管生成。另外，細(xì)胞凋亡是在各種生理或病理因素的作用下，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，是機(jī)體為適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)自殺的過(guò)程。AQP8和AQP9表達(dá)于正常肝臟。AQP8主要定位于細(xì)胞內(nèi)，而AQP9主要定位于細(xì)胞膜，肝癌細(xì)胞上AQP8和AQP9表達(dá)下降。并且這些細(xì)胞對(duì)滲透壓和凋亡刺激的反應(yīng)性下降。肝癌細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的反應(yīng)減少，則腫瘤細(xì)胞死亡數(shù)量減少，意味著腫瘤生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)與丟失分?jǐn)?shù)之比增加，腫瘤可以不斷長(zhǎng)大。上述的AQP5改變腫瘤生物學(xué)行為可能是在幾條導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路中起調(diào)節(jié)作用，包括由Src家族酪氨酸激酶、表皮生長(zhǎng)因子受體、Wnt信號(hào)和Erk1/2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11，17-18］。最近，LEE等［12］報(bào)道，AQP5與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示AQP5作為乳腺癌預(yù)后指標(biāo)的價(jià)值。HUANG等［19］證實(shí)，AQP5促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移。王巍等［20］進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明，AQP5主要表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞，在癌旁組織中幾乎不表達(dá)。結(jié)直腸癌中AQP5的臨床意義尚未有定論。我們的研究結(jié)果表明，AQP5主要表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞中，在癌旁組織和正常組織中呈低表達(dá)。本研究中檢測(cè)到的結(jié)直腸組織中AQP5表達(dá)譜與以前研究結(jié)果相一致。此外，我們分析了AQP5與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果表明，AQP5與患者的年齡、性別無(wú)顯著性相關(guān)性，而與腫瘤分化、TNM分期和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究初步證實(shí)了AQP5在結(jié)直腸癌中可能的作用部位，具體AQP5通過(guò)何種機(jī)制影響結(jié)直腸癌進(jìn)展，有必要在細(xì)胞分子生物學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討，這也是本課題組下一步的方向。

總之，本階段研究提示AQP5蛋白在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，與高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后緊密相關(guān)。因此，AQP5可作為結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的新的生物標(biāo)志物。

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（編輯 韓維棟）

Expression of AQP5 in colorectal cancer and its relationship with clinical outcome

SHAN Tao1，ZHENG Bo1，CHEN Xi1，WU Tao1，JI Er-li1，BAI Yu-hua1，WANG Ji-xin1，XIAO Xiao-ling2
（1.Department of General Surgery；2.Operation Room，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710004，China）

ObjectiveTo determine the relationship of the expression of aquaporin 5（AQP5）with clinicopathology and prognosis of colorectal cancer.MethodsWe collected data from 45 patients with primary colorectal cancer without any adjuvant therapy before operation.The expression of AQP5 was measured by immunohistochemistry（IHC）.Then we analyzed the correlation between AQP5 expression and clinicopathological parameters（including age，tumor size，clinical staging，tumor location，lymph node and pathological type）and the connection between AQP5 expression and prognosis based on follow-up data.ResultsOf the 45 tumor specimens，14（31.1%）had a high level of AQP5 expression，29（64.4%）exhibited a moderate level of staining，and 2（4.4%）had an absence of AQP5 staining.AQP5 was only occasionally detected in para-neoplastic［3/45（6.67%）］and normal tissues［3/45（6.67%）］.The overexpression of AQP5 was also positively associated with TNM stage（P=0.002），lymph node metastasis（P=0.016），and distant metastasis（P=0.000）.However，it had no significant association with age，gender，histologic grade or tumor size（P＞0.05）.ConclusionAQP5 may be used as a novel biomarker for predicting the prognosis of colorectal cancer.

colorectal cancer；aquaporin 5（AQP5）；prognosis

R735.3

A

10.7652/jdyxb201506020

2015-03-03

2015-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81402583）；陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.2014JQ4165）

Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81402583）and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province（No.2014JQ4165）

陳熹.E-mail：Chenxi@163.com.鄭波同為第一作者.

優(yōu)先出版：http：//w ww.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150928.1505.006.html（2015-09-28）