劉麗娜，李 瑤，楊永秀，3，王慧君，趙靜妮

（1.甘肅省婦幼保健院婦產(chǎn)科，甘肅蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)，甘肅蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅蘭州 730000）

◇臨床研究◇

MCM5和P16INK4A在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

劉麗娜1，2，李 瑤1，楊永秀1，3，王慧君2，趙靜妮2

（1.甘肅省婦幼保健院婦產(chǎn)科，甘肅蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)，甘肅蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅蘭州 730000）

目的探討微小染色體維持蛋白-5（MCM5）與P16INK4A在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常宮頸組織中的表達(dá)及其意義。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）和免疫組化法，分別檢測(cè)MCM5和P16INK4Am RNA及蛋白在40例宮頸癌組織、11例低度宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅠ）、15例高度宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅡ～Ⅲ）和15例正常宮頸組織中的表達(dá)。結(jié)果①各不同宮頸組織中MCM5和P16INK4AmRNA及蛋白的表達(dá)趨勢(shì)一致。宮頸癌組織中MCM5和P16INK4AmRNA的表達(dá)量和蛋白表達(dá)率均高于CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和正常宮頸組織。MCM5基因和蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)均比正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；P16INK4A基因和蛋白在宮頸癌中的表達(dá)比正常宮頸組織、CINⅠ高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而與CINⅡ～Ⅲ間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。②MCM5 m RNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)率與臨床期別、分化程度相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05）；P16INK4Am RNA和蛋白表達(dá)與臨床期別、年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與分化程度相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。③在宮頸癌組織中MCM5和P16INK4A表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.538，P＜0.01）。結(jié)論MCM5和P16INK4A的高表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。MCM5可能成為宮頸癌腫瘤增生的新標(biāo)志物；其與P16INK4A聯(lián)合檢測(cè)有助于進(jìn)行CIN的分級(jí)和轉(zhuǎn)歸判斷，有望提高宮頸癌的篩查率。

微小染色體維持蛋白5（MCM5）；P16INK4A；宮頸鱗癌；免疫組化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

宮頸癌是全球女性最常見的第3大惡性腫瘤，也是導(dǎo)致女性癌癥死亡的第4大原因［1］。統(tǒng)計(jì)顯示，每年全球約有新發(fā)病例529 800人，而275 100人死于宮頸癌［2］。癌前病變中出現(xiàn)生物分子水平的異常，有助于在分子水平尋找新的有效生物標(biāo)志物，進(jìn)一步完善宮頸癌篩查，降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。微小染色體維持蛋白-5（minichromosom maintenance proteins 5，MCM5）是微小染色體維持蛋白家族的成員之一，是近年腫瘤研究中新的細(xì)胞增殖生物指標(biāo)，可作為增殖細(xì)胞的特殊生物標(biāo)記物。DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)紊亂可使基因變得不穩(wěn)定，從而引起細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。MCM5在DNA復(fù)制的起始、延伸過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，是影響微染色體有絲分裂穩(wěn)定性的主要基因［3］。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失控有關(guān)，P16INK4A作為抑癌基因直接參與細(xì)胞周期調(diào)控，可能參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究采用Real-time PCR和免疫組化法檢測(cè)不同宮頸組織中MCM5和P16INK4A的表達(dá)，探討其與宮頸鱗癌臨床病理特征間的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及一般情況收集2012年8月至2013年5月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科住院經(jīng)宮頸活檢及手術(shù)切除的66例患者的新鮮宮頸組織標(biāo)本，其中11例CINⅠ，15例CINⅡ-Ⅲ，40例宮頸鱗癌。鱗癌患者平均年齡41歲（≤40歲16例，＞40歲24例）。病理分級(jí)：高分化鱗癌（G1）9例，中分化鱗癌（G2）23例，低分化鱗癌（G3）8例。臨床分期（按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO 2009年標(biāo)準(zhǔn)）：Ⅰa期5例，Ⅰb期10例，Ⅱa期9例，Ⅱb期16例。所有病例均未進(jìn)行過(guò)化療、放療。切除的宮頸標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)診斷。另取同期因子宮肌瘤或子宮脫垂行全子宮切除術(shù)患者的新鮮宮頸組織標(biāo)本15例作為對(duì)照組。所有組織標(biāo)本離體后分2份，一份迅速放入液氮凍存，另外一份置于100 mL/L的甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 主要試劑及儀器RNAiso Plus RNA提取試劑、PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix EX TaqTMⅡ熒光Real-time PCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生物公司。Real-time PCR儀（LightCycler480）；兔抗人MCM5單克隆抗體、鼠抗人P16INK4A單克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)MCM5和P16INK4A引物由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成，內(nèi)參β-actin由上海生物工程公司設(shè)計(jì)合成。MCM5上游引物：5′-GAGATGCCCAGACACATGCAG-3′，下游引物：5′-ATGGAGTAGATGCCCATGATGGTA-3′，產(chǎn)物大小95 bp；P16INK4A上游引物：5′-CCCCACTACCGTAAATGTCCA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，產(chǎn)物大小114 bp；β-actin上游引物：5′-TCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′。

1.4 Real-time PCR法檢測(cè)MCM5和P16INK4AmRNA的表達(dá)

1.4.1 組織總RNA提取和cDNA合成 取50 mg待測(cè)樣本組織，應(yīng)用Plus RNA提取液，提取組織總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定其純度，A（260）/A（280）值在1.8～2.1之間，之后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每20μL反應(yīng)體系中加入500 ng總RNA，反應(yīng)體系為20μL，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃。反應(yīng)后cDNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR及數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)MCM5和P16INK4AmRNA的相對(duì)表達(dá)量，按照TaKaRa熒光定量PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。20μL PCR反應(yīng)體系：其中cDNA含量為2μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，95℃5 s，60℃20 s。循環(huán)結(jié)束后，繪制溶解曲線95℃1 min，65℃15 s；降溫37℃30 s。由LightCycle Real-Time PCR軟件自動(dòng)記錄熒光曲線并分析計(jì)算出Ct值。采用相對(duì)定量2-ΔΔct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，按以下公式計(jì)算：ΔΔCt =（目的基因Ct值-對(duì)應(yīng)內(nèi)參Ct值）病例組-（目的基因的Ct-內(nèi)參Ct）對(duì)照組的均值，以β-actin作為內(nèi)參，以正常對(duì)照作為基準(zhǔn)，以2-ΔΔct表示實(shí)驗(yàn)組宮頸組織中mRNA的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)［4］。

1.5 免疫組化SABC法檢測(cè)MCM5和P16INK4A蛋白的表達(dá)常規(guī)石蠟切片脫蠟、水化，微薄修復(fù)后進(jìn)行SABC法免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按照SABC試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：MCM5以細(xì)胞核呈棕黃色染色為陽(yáng)性標(biāo)志。染色判斷參考BUKHOLM等［5］提出的標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)數(shù)≥500個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比率：＜10%為（-），10%～30%為（+），31%～70%為（++），＞70%為（+++）。P16INK4A陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色染色。觀察有10個(gè)代表性視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色程度判斷結(jié)果［6］。陰性：陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜10%或染色強(qiáng)度與背景顏色無(wú)明顯差異；弱陽(yáng)性（+）：陽(yáng)性細(xì)胞百分率10%～30%，染色強(qiáng)度較弱；中度陽(yáng)性（++）：陽(yáng)性細(xì)胞百分率31%～60%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：陽(yáng)性細(xì)胞百分率＞60%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。熒光定量PCR結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；兩組間比較，當(dāng)方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)；多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。免疫組化為計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman秩相關(guān)性分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性MCM5、P16INK4A基因的溶解曲線均顯示為銳利的單一峰集中，無(wú)其他非特異峰形，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好。

2.2 MCM5和P16INK4A的mRNA在不同宮頸組織中的表達(dá)以正常宮頸組織中MCM5和P16INK4AmRNA的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)。從正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ到宮頸癌，MCM5 mRNA的表達(dá)量呈漸進(jìn)性增高，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=55.03，P＜0.001）。宮頸鱗癌組織中MCM5 mRNA的表達(dá)量分別高于正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MCM5 mRNA在CINⅠ與CINⅡ～Ⅲ間表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.911，表1）。

P16INK4AmRNA從正常組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ到宮頸癌組織，其表達(dá)量呈漸進(jìn)增高。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=44.147，P＜0.01）。P16INK4AmRNA在宮頸癌中的表達(dá)量高于正常宮頸組織、CINⅠ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其表達(dá)量亦高于CINⅡ～Ⅲ，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.100）。正常宮頸組織與CINⅠ之間，其表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.194，表1）。

表1 不同宮頸組織中MCM5和P16INK4AmRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab.1 Expressions of MCM5 and P16INK4Am RNA in different cervical tissues

2.3 MCM5和P16INK4A mRNA表達(dá)水平與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系不同年齡組宮頸癌組織中MCM5 mRNA表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其與臨床分期有關(guān)，MCM5 mRAN的表達(dá)量Ⅱa～Ⅱb期高于Ⅰa～Ⅰb期（P＜0.05）。癌組織的病理學(xué)分級(jí)中，MCM5 m RNA的表達(dá)量隨分級(jí)的升高而增高，其中G1中的表達(dá)低于G2、G3，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而G2與G3間MCM5 mRNA表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.857，表2）。

P16INK4AmRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)量與年齡無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。而在宮頸癌臨床分期中，P16INK4AmRNA的表達(dá)量Ⅰa～Ⅰb期高于Ⅱa～Ⅱb期，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。P16INK4AmRNA在癌組織分化程度中，從G1、G2到G3其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，G1高于G2、G3，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而P16INK4AmRNA在G2與G3的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.114，表2）。

2.4 MCM5和P16INK4A蛋白在宮頸鱗癌中的表達(dá)MCM5在正常宮頸組織內(nèi)為弱表達(dá)，且僅限于基底層。CIN隨著級(jí)別的進(jìn)展，其陽(yáng)性細(xì)胞從基底層上移，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多（圖1）。MCM5在宮頸鱗癌組織中陽(yáng)性呈彌漫分布，且染色增強(qiáng)（圖1）。從正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ到宮頸鱗癌，MCM5陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，宮頸鱗癌中MCM5表達(dá)率分別高于正常宮頸組織、CINI、CINⅡ～Ⅲ，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而CINI與CINⅡ～Ⅲ之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表2 宮頸癌組織中MCM5和P16INK4AmRNA的相對(duì)表達(dá)量與臨床病理的關(guān)系Tab.2 Relationship of MCM5 and P16INK4AmRNA expressions in cervical cancer tissues with clinicopathological features

圖1 MCM5在CINⅠ、CINⅢ、宮頸癌組織中的表達(dá)Fig.1 MCM5 protein expression in CINⅠ，CINⅢand cervical cancer tissues（SABC，×200）

P16INK4A的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)（圖2）。P16INK4A在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0%、27.3%、86.7%、97.5%。在正常宮頸組織與CINI之間、宮頸癌組織與CINⅡ～Ⅲ之間，表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但宮頸癌組織與正常宮頸組織、CINⅠ之間，正常宮頸組織與CINⅡ～Ⅲ之間，CINⅠ與CINⅡ～Ⅲ之間，P16INK4A陽(yáng)性表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

2.5 MCM5和P16INK4A蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及二者的相關(guān)性MCM5蛋白的表達(dá)與年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與臨床分期和病理分化程度有關(guān)。P16INK4A蛋白的表達(dá)與年齡、臨床分期均無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與病理學(xué)分級(jí)有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）。在宮頸癌組織中MCM5與P16INK4A的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.538，P＜0.01，表5）。

圖2 P16INK4A在CINⅠ、CINⅢ、宮頸癌組織中的表達(dá)Fig.2 P16INK4Aprotein expression in of CINⅠ，CINⅢand cervical cancer tissues（SABC，×200）

表3 MCM5和P16INK4A在不同組宮頸組織中的陽(yáng)性表達(dá)Tab.3 MCM5 and P16INK4Aprotein expressions in different cervical tissues

表4 宮頸癌組織中MCM5和P16INK4A蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系Tab.4 Relationship of MCM5 and P16INK4Aprotein expressions in cervical cancer tissues with clinicopathological features

表5 宮頸癌組織中MCM5和P16INK4A蛋白表達(dá)的相關(guān)性Tab.5 Correlation between expressions of MCM5 and P16INK4Aprotein in cervical cancer

3 討 論

腫瘤的形成與細(xì)胞周期調(diào)控失常和細(xì)胞的增殖調(diào)控異常有關(guān)。DNA復(fù)制是細(xì)胞周期中不可或缺的一部分，MCM家族是啟動(dòng)DNA復(fù)制的重要部分且與細(xì)胞的增殖有關(guān)［7］。MCM蛋白在G1/S期達(dá)到峰值，進(jìn)入靜止期（G0期）或分化、衰老時(shí)，其表達(dá)下降或不表達(dá)，MCM5是MCM蛋白家族的成員，故可作為反映細(xì)胞增殖活性的特異分子標(biāo)記物［8-9］。本研究結(jié)果顯示，MCM5 mRNA和蛋白的表達(dá)變化從低級(jí)宮頸內(nèi)瘤變開始，且陽(yáng)性細(xì)胞隨著病變程度不同，累積上皮范圍亦不同，故可認(rèn)為MCM5是宮頸癌發(fā)生的早期事件，可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。MURPHY等［10］研究顯示，MCM5 mRNA在正常宮頸、CIN、宮頸鱗癌中的表達(dá)呈線性升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCM5 mRNA和蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)均明顯高于正常組、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ，且其蛋白和基因表達(dá)趨勢(shì)一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似，提示MCM5的高表達(dá)與宮頸病變本身增殖活性程度一致。MCM蛋白是一種更理想的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，與增殖細(xì)胞抗原PCNA、Ki-67傳統(tǒng)細(xì)胞增殖標(biāo)志物相比，全面且準(zhǔn)確反映細(xì)胞增殖活性［11-13］。MCM5的檢測(cè)可以代表MCM蛋白家族，因此MCM5的表達(dá)可以反映宮頸不同增殖階段中細(xì)胞的增殖活性，可作為宮頸病變細(xì)胞增殖特異性相關(guān)因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCM5的表達(dá)隨著宮頸病變程度升高而增加，MCM5蛋白和mRNA的表達(dá)在正常宮頸組織與CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ與宮頸癌比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而CINⅠ與CINⅡ～Ⅲ比較無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。因此，可以推斷MCM5的高表達(dá)不但標(biāo)志著惡性細(xì)胞的增殖，且標(biāo)志著非典型性細(xì)胞和潛在惡性細(xì)胞的增生，故MCM5可能成為區(qū)分宮頸正常黏膜、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸鱗癌的細(xì)胞增殖標(biāo)記物，并且是惡性腫瘤和不典型增生的重要標(biāo)記物，有望成為宮頸癌前病變及宮頸癌輔助診斷的指標(biāo)。其與HA等［14］在人體多種腫瘤中對(duì)MCM蛋白測(cè)定結(jié)果和意義相近。WILLIAMS等［15］提出，將MCM5抗體檢測(cè)應(yīng)用于宮頸涂片來(lái)診斷異常的有惡變潛能的細(xì)胞具有高度的特異性和敏感性。本研究中MCM5的表達(dá)在CINⅠ與CINⅡ～Ⅲ之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故推測(cè)不能依據(jù)MCM5的基因和蛋白表達(dá)變化判斷CIN的分級(jí)，但可根據(jù)其在宮頸內(nèi)瘤變組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)CIN是否具有潛在的惡變?cè)鲋衬芰?、發(fā)展為惡性腫瘤的危險(xiǎn)性大小及轉(zhuǎn)歸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在宮頸癌組織中隨著腫瘤惡性程度的增加，MCM5基因和蛋白表達(dá)水平升高，與宮頸惡性腫瘤的分化程度呈反比，而與臨床分期呈正比，即惡性程度越高，細(xì)胞的增殖也越旺盛，MCM5的表達(dá)水平也就越高。提示，MCM5與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，能夠反映腫瘤中增生細(xì)胞的狀況，與腫瘤的惡性程度有關(guān)。故檢測(cè)MCM5的表達(dá)水平可能有助于判斷宮頸癌的惡性程度。

P16INK4A基因又稱多種腫瘤抑制基因（MTS1），參與細(xì)胞周期調(diào)控。P16INK4A基因及其產(chǎn)物的失活引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致腫瘤的形成［16-17］。有研究顯示，在大多數(shù)惡性腫瘤中P16INK4A基因表達(dá)缺失，但國(guó)內(nèi)外對(duì)宮頸癌P16INK4A的研究結(jié)果不盡相同，多報(bào)道為過(guò)表達(dá)［18］。一般在病變?cè)缙谛螒B(tài)學(xué)改變未被觀察到時(shí)，已經(jīng)可以在基因水平觀察和檢測(cè)到分子生物標(biāo)志物的改變，故本研究完成P16INK4A從基因到蛋白水平在不同宮頸病變組織中的檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)，P16INK4Am RNA表達(dá)量隨宮頸病變程度的增加而升高；P16INK4A蛋白在正常組織中表達(dá)為陰性，而在CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌中均有表達(dá)，且隨著病變的進(jìn)展其陽(yáng)性表達(dá)率和染色程度呈上升趨勢(shì)，與MULVANY等［19］和楊君等［20］的研究結(jié)果一致。故可推斷，P16INK4A高表達(dá)可能是宮頸癌發(fā)生的早期事件，P16INK4A參與宮頸病變的演變過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中P16INK4A在低級(jí)內(nèi)瘤變和高級(jí)內(nèi)瘤變中陽(yáng)性表達(dá)率有顯著性差異，但其在CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌之間的表達(dá)無(wú)差異。有研究顯示，P16INK4A在低級(jí)內(nèi)瘤變中表達(dá)陽(yáng)性者比陰性者更容易向高級(jí)宮頸病變發(fā)展［21-25］，故推測(cè)P16INK4A可能成為宮頸上皮內(nèi)瘤變低、高分級(jí)的可靠指標(biāo)，可以預(yù)測(cè)CIN的轉(zhuǎn)歸，但不能預(yù)測(cè)高級(jí)內(nèi)瘤變是否進(jìn)展為宮頸惡性腫瘤。檢測(cè)P16INK4A作為診斷宮頸癌前病變的輔助分子標(biāo)志物，有望提高宮頸癌前病變篩查的準(zhǔn)確性。ELEUTERIO［26］的研究顯示，在CIN輔助診斷中P16INK4A蛋白表達(dá)檢測(cè)比HR-HPV更敏感。故將P16INK4A與MCM5聯(lián)合檢測(cè)有助于區(qū)分低、高度宮頸上皮內(nèi)瘤變及發(fā)現(xiàn)具有潛在惡變?cè)鲋沉Φ膶m頸內(nèi)瘤變，尤其對(duì)預(yù)測(cè)CIN轉(zhuǎn)歸及合理治療有著重要的臨床意義。SAHEBALI等［27］的研究顯示，聯(lián)合P16INK4A檢測(cè)應(yīng)用于宮頸癌的篩查有助于提高HPV檢測(cè)的特異性和細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性。提示P16INK4A可作為CIN分級(jí)的輔助診斷、預(yù)測(cè)病情進(jìn)展及早期篩查的生物學(xué)指標(biāo)，有助于提高宮頸癌前病變的診斷率。

綜上所述，MCM5及P16INK4A均為宮頸癌的早期事件。MCM5是反應(yīng)細(xì)胞增殖狀態(tài)的可靠標(biāo)志物，并根據(jù)增殖狀況來(lái)判斷CIN是否具有潛在的惡變?cè)鲋衬芰斑M(jìn)展為宮頸癌的危險(xiǎn)性，且能反映宮頸癌的惡性程度；而P16INK4A有助于CIN的分級(jí)及預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)歸，所以二者聯(lián)合檢測(cè)，可以補(bǔ)充HPV對(duì)高級(jí)別內(nèi)瘤變陽(yáng)性預(yù)測(cè)率低和細(xì)胞學(xué)敏感性差的缺點(diǎn)，可能有助于發(fā)現(xiàn)具有惡性潛能的CIN并判斷宮頸內(nèi)瘤變的程度，可成為CIN的診斷、分級(jí)及判斷其轉(zhuǎn)歸的有效指標(biāo)。故二者與HPV等聯(lián)合檢測(cè)可以完善宮頸癌及癌前病變的篩查，提高篩查率。

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（編輯 卓選鵬）

Expressions of MCM5 and P16INK4Ain cervical squamous cell carcinoma

LIU Li-na1，2，LI Yao1，YANG Yong-xiu1，3，WANG Hui-jun2，ZHAO Jing-ni2
（1.Department of Gynecology and Obstetrics，Gansu Provincial Maternity and Child-care Hospital，Lanzhou 730050；2.Department of Gynecology and Obstetrics，the First Clinical Medicine College of Lanzhou University，Lanzhou 730000；3.Department of Gynecology and Obstetrics，the First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

ObjectiveTo investigate the expressions of minichromosome maintenance protein 5（MCM5）and P16INK4Agene and protein in cervical squamous cell cancer（SCC），cervical intraepithelial neoplasia（CIN）and normal tissues.MethodsReal-time PCR and immunohistochemistry were used respectively to detect the expression levels of m RNA and protein of MCM5 and P16INK4Ain 40 cases of cervical cancer，11 cases of CIN I，15 cases of CINⅡ-Ⅲand 15 cases of normal cervical tissues.Results①The expression levels of mRNA and protein of MCM5 and P16INK4Ain tissues of cervical squamous cell cancer were significantly higher than those in normal cervical tissues，CIN I and CINⅡ-Ⅲtissues（P＜0.05）.The expression level of P16INK4Awas significantly higher in tissues of cervical squamous cell cancer than in normal cervical tissues and CIN I tissues（P＜0.01）. However，it did not differ from that in CINⅡ-Ⅲtissues（P＞0.05）.②The high expression of MCM5 m RNA and protein in cervical squamous cell carcinoma was positively correlated with clinical stage and differentiation grade of cervical cancer（P＜0.01），but not correlated with age（P＞0.05）.P16INK4Aexpression exhibited no correlation with clinical stage or age of patients（P＞0.05），but positive correlation with dif ferentiation grade（P＜0.01）.③A positive correlation was found between MCM5 and P16INK4Aexpressions in cervical cancer（r=0.538，P＜0.01）.ConclusionThe over-expressions of MCM5 and P16INK4Amay play an important role in the carcinogenesis and progression of cervical cancer.MCM5 may be used as a new marker of the proliferation of cervical cancer. Detection of P16INK4Aand MCM5 is of great significance to studying the grade and outcome of CIN，which may improve the rate of cervical cancer screening.

minichromosom maintenance protein 5（MCM5）；P16INK4A；cervical cancer；immunohistochemistry；real-time PCR

R711.74

A

10.7652/jdyxb201506023

2015-01-12

2015-02-08

楊永秀.E-mail：yongxiuyang@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150527.1500.011.html（2015-05-27）