徐國發(fā)　鄭仕萍　張建博等

摘要：目的研究和分析單寧酸在不同pH的磷酸鹽緩沖液中水解后的含量變化。方法采用在常溫下觀察單寧酸在不同pH的磷酸鹽緩沖液（pH分別為2、3、4、5、6）中的水解情況，應(yīng)用反相高效液相色譜儀測定單寧酸及其水解產(chǎn)物沒食子酸含量，并比較和分析單寧樣品液水解前后單寧酸和沒食子酸含量變化。結(jié)果單寧酸隨著pH值的上升，其含量呈逐漸下降的趨勢，沒食子酸的含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。結(jié)論單寧酸及其水解產(chǎn)物沒食子酸在不同pH條件下的含量變化反映了酸堿度對單寧酸水解反應(yīng)的影響，本實驗研究可為單寧酸在中藥提取加工、養(yǎng)護、儲存等方面的應(yīng)用提供一定參考。

關(guān)鍵詞：單寧酸；水解反應(yīng)；沒食子酸 pH；磷酸鹽緩沖液

中圖分類號：R284文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2015）06-0088-03

單寧酸（Tannic acid）是一種存在于多種天然藥用植物的多元酚類化合物，具有很強的生物和藥理活性，是具有重要開發(fā)價值的天然產(chǎn)物[1]。分子式C76H52O46，能溶于乙醇、水、丙酮，幾乎不溶于苯、乙醚、石油醚、氯仿等[2]。，是沒食子酸酯及其衍生物與葡萄糖或多酚通過酯鍵相連形成的化合物，遇酸、堿、酶能夠水解，水解時能生成雙沒食子酸酯，雙沒食子酸酯能進一步水解成沒食子酸和葡萄糖等小分子化合物[3-5]。單寧酸存在于多種植物的樹皮和果實中，如中國五棓子、塔拉果莢、石堅石榴、漆樹葉、黃護、金縷梅樹、柿子、君遷子、葡萄、李子、梨、山核桃、橘子、桃子、山楂、茶葉等。單寧酸在醫(yī)學(xué)上能用于收斂、止血、抗菌消炎、止瀉、驅(qū)蟲、抗多種病原體感染，對化學(xué)誘變的皮膚、肺、前胃腫瘤有很好的抑制作用，能與細胞外或組織外的鈣離子絡(luò)合.可抵抗平滑肌鈣誘導(dǎo)的收縮，發(fā)揮降血壓作用[6]，能夠阻礙鳥氨酸脫羧酶的誘導(dǎo)和過氧化物的產(chǎn)生，提高老鼠體內(nèi)的抗氧化和抗癌效果[7]，對HIV-RT有一定抑制活性[8]，還具有抗突變、抗脂質(zhì)過氧化、改善肝腎功能、降脂等作用[9]。食品領(lǐng)域中能作酒類和飲料的澄清劑、穩(wěn)定劑以及食品添加劑中的輔色、調(diào)味、賦形等[10-12]，此外單寧酸在制革、日化、冶金、染料、電子及輕工等領(lǐng)域中也應(yīng)用廣泛。

沒食子酸（Gallic acid）也是一種多酚類弱酸性化合物?；瘜W(xué)式為C7H6O5，化學(xué)命名為 3，4，5-三羥基苯甲酸[13]。通常以糖苷鍵或酯鍵的形式與多元醇結(jié)合成水解單寧存在于植物體和果實中，能溶于熱水、乙醇、乙醚、甘油和丙酮，難溶于冷水，不溶于苯和氯仿。在堿性和中性條件下較不穩(wěn)定，而對強酸（1mol/L）、強光、高溫較穩(wěn)定，在pH為2～6的磷酸鹽緩沖液條件下能保持相對穩(wěn)定[14]。沒食子酸對肝臟、腎臟、心血管有較強的親和力，具有抗突變、抗炎、抗氧化、抑菌、降血糖、心血管保護等生物學(xué)效應(yīng)，其中對腫瘤、多種致癌、促癌物有突出的抵抗作用[15-20]。

單寧酸和沒食子酸作為一種在醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有重要作用的多酚類鞣質(zhì)，為合理地利用單寧酸等多酚類鞣質(zhì)，本實驗根據(jù)單寧酸的化學(xué)性質(zhì)及沒食子酸的穩(wěn)定性，觀察單寧酸在不同pH緩沖溶液中水解后含量及其產(chǎn)物沒食子酸的含量變化情況。

1實驗材料與儀器

1.1實驗藥品單寧酸樣品（購自成都邁斯克公司）；單寧酸對照品（購自云南省藥檢所）；沒食子酸對照品（購于昆明中檢所）；

1.2儀器與試劑Agilent1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；分析天平；電子天平；精密pH測定儀計（0.01pH）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋；移液管；燒杯；玻璃棒；容量瓶；0.45um微孔濾膜；1mL注射器；甲醇（色譜純）；磷酸（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；丙酮（分析純）；純化水；

2實驗方法

2.1磷酸鹽緩沖液的配制A液：取磷酸16.6 mL，加純化水至1000 mL，搖勻。B液：稱取磷酸氫二鈉71.63 g，加純化水使溶解成1000 mL。取上述A液72.5 mL與B液27.5 mL混合配制，搖勻，即得pH=2.00的緩沖液。以pH=2的緩沖液為基本底液，再用純化水將其稀釋成pH為2、3、4、5、6的緩沖液。

2.2對照品溶液的制備取沒食子酸對照品適量，于分析天平上精密稱定，加50%甲醇溶解配制定容成每1 mL含25 μg的溶液，即得；取單寧酸對照品適量，于分析天平上精密稱定，用乙醇：水：丙酮（69.9%：29.8%：0.3%）溶解定容成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備取單寧酸樣品適量，精密稱定樣品0.00500 g，以乙醇：水：丙酮（69.9%：29.8%：0.3%）溶解，配制定容成每1 mL含20 μg的溶液25 mL。取移液管分別吸取制備好的單寧酸樣品溶液1 mL，放入固定體積的不同pH的磷酸鹽緩沖液中，超聲使其溶解和混勻，以恒溫水浴鍋控制水浴環(huán)境溫度在25±0.5℃，讓單寧酸樣品溶液在恒溫條件下充分水解1 h，對水解后的樣品液用微孔濾膜（0.45 um）進行過濾后，即得供試品溶液。

2.4色譜條件

2.4.1單寧酸色譜條件色譜柱ZoRBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 um）；流動相：甲醇-水（80：20）；柱溫：室溫；檢測波長：275 nm；流速：0.5 mL/min；進樣量：2 uL[21]。

2.4.2沒食子酸色譜條件色譜柱ZoRBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 um）；流動相：甲醇和0.2%磷酸（5：95）；柱溫：25℃；檢測波長：273 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 uL。

2.5標準曲線的繪制

2.5.1單寧酸標準曲線的繪制于分析天平上精密稱定定量的單寧酸對照品，以乙醇：水：丙酮（69.9%：29.8%：0.3%）溶解定容配制成每1 mL含31μg的溶液，按上述單寧酸色譜條件分別取1、3、5、7、9ul不同體積進樣，以單寧酸的峰面積（Y）對標準品的質(zhì)量（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=5261.5X-24.993，R2=0.9987，結(jié)果表明：單寧酸峰面積值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.132-0.396 ug。

2.5.2沒食子酸標準曲線的繪制取沒食子酸對照品適量，于分析天平上精密稱定，加50%甲醇溶解配制定容成每1 mL含33μg的溶液，按上述色譜條件分別進樣4、6、8、10、12 μL，以沒食子酸的峰面積（Y）對標準品質(zhì)量（X）進線性回歸，得方程Y=1740.2x-68.001，R2=0.9964，結(jié)果表明：沒食子酸峰面積值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.062-0.31 ug。

2.6單寧酸和沒食子酸的含量測定分別取2.3項下方法制備的供試品溶液，按2.4色譜條件分別測定單寧酸、沒食子酸在不同pH的磷酸鹽緩沖液條件下的含量，用外標法進行計算。

3實驗結(jié)果與分析

3.1從圖中可以看出，在pH2～6的范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，單寧酸含量逐漸減少（見圖3），沒食子酸含量逐漸增加（見圖4）。據(jù)此表明單寧在接近中性環(huán)境中更易水解產(chǎn)生沒食子酸。

3.2從表1中的數(shù)據(jù)中可以看出，當(dāng)pH 2～4的范圍內(nèi)，單寧酸含量下降速度快，pH 5～6時單寧酸含量下降速度慢，而沒食子酸含量在pH 2～4范圍內(nèi)上升慢，在pH 5～6時含量上升快，說明在pH 2～4范圍極大部分的單寧并未轉(zhuǎn)化為沒食子酸，其有可能產(chǎn)生1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖（β-PGG）、雙沒食子酸酯、雙沒食子酸等其它的多酚化合物。說明pH2～4在不利于單寧酸酯鍵斷裂產(chǎn)生沒食子酸。

3.3通過實驗數(shù)據(jù)分析單寧酸和沒食子酸的含量變化，可以初步認為在溫和的pH條件下更有利于單寧的酯鍵或苷鍵斷裂產(chǎn)生沒食子酸。

4結(jié)論

單寧酸和沒食子酸存在于多種藥用植物中，具有很強的藥學(xué)活性，在醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣闊開發(fā)利用的前景。通過實驗測定和分析單寧酸及其產(chǎn)物沒食子酸在不同pH條件下的含量變化情況，讓我們進一步認識了單寧酸和沒食子酸的化學(xué)穩(wěn)定性，此實驗可為進一步了解和研究單寧酸及多酚化合物理化性質(zhì)提供一定參考，也為醫(yī)藥及相關(guān)領(lǐng)域?qū)螌幩岬暮侠砝锰峁┮欢ǖ膮⒖肌?/p>

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（收稿日期：2015-03-23）