郭鳳霞 陳路曉 劉斌 姜艷艷

人參中人參皂苷類(lèi)成分含量測(cè)定方法優(yōu)化

郭鳳霞 陳路曉 劉斌 姜艷艷

目的 優(yōu)化人參中皂苷類(lèi)成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量測(cè)定方法。方法 采用單因素考察方式,對(duì)提取方式、提取溶劑、溶劑倍量和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行考察,采用HPLC法測(cè)定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量,分析比較含量測(cè)定結(jié)果。結(jié)果 人參中皂苷類(lèi)成分含量測(cè)定供試品溶液制備最佳方法為采用50倍的70%甲醇回流提取人參2.5小時(shí)。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)所建立的方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好,為人參皂苷的含量測(cè)定提供較優(yōu)方法。

人參皂苷; 含量測(cè)定; 優(yōu)化

人參為五加科植物人參Panax gineseng C.A. Mey的干燥根和根莖,為常用名貴藥材。人參具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血和安神益智的功效,臨床上用于體虛欲脫,脾虛食少,肺虛喘咳,津傷口渴,氣血虧虛。人參中主要含有皂苷、多糖、揮發(fā)油等化學(xué)成分[1],《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)[2]中,以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1為含量測(cè)定指標(biāo)性成分,對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。在《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)人參“含量測(cè)定”項(xiàng)下供試品溶液制備方法中,人參藥材粉末采用氯仿連續(xù)回流提取,藥渣揮去氯仿,再用水飽和正丁醇浸泡,放置過(guò)夜后超聲處理提取皂苷類(lèi)成分?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(一部)中規(guī)定人參中人參皂苷含量限度為含人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總量不得少于 0.30%,人參皂苷 Rb1不得少于0.20%。

在采用人參含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行供試品溶液制備時(shí),發(fā)現(xiàn)該方法存在以下問(wèn)題:(1)該方法中,氯仿回流提取的目的是為了除去脂溶性雜質(zhì),而實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn),人參藥材粉末采用氯仿連續(xù)回流提取后,氯仿提取液幾乎無(wú)色,且蒸干后殘?jiān)亢苌?此步驟未除去脂溶性雜質(zhì);(2)采用水飽和正丁醇提取人參皂苷時(shí),先放置過(guò)夜(約12小時(shí)),再超聲處理,此過(guò)程所需時(shí)間太長(zhǎng),且無(wú)實(shí)際意義,故“放置過(guò)夜”步驟可以省略;超聲處理提取皂苷類(lèi)成分時(shí),發(fā)現(xiàn)所得正丁醇提取液顏色較淺,溶液蒸干后,所得殘?jiān)枯^少,且平行操作兩份差距較大。綜合分析實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果,并結(jié)合文獻(xiàn)[3-5]中方法推測(cè),采用正丁醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲處理,未能把人參中皂苷類(lèi)成分提取完全,故導(dǎo)致含量測(cè)定結(jié)果偏低且誤差較大。其原因可能在于正丁醇為脂溶性有機(jī)溶劑,在提取過(guò)程中,不能有效穿透細(xì)胞膜,因而不能將皂苷類(lèi)成分完全溶出。

中藥指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法的正確性、合理性是中藥質(zhì)量控制和開(kāi)發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)。針對(duì)人參中人參皂苷類(lèi)成分含量測(cè)定方法中供試品溶液制備過(guò)程的不合理問(wèn)題,本文擬對(duì)人參中皂苷類(lèi)成分含量測(cè)定中供試品制備方法進(jìn)行優(yōu)化,以保證人參含量測(cè)定結(jié)果的真實(shí)可靠,結(jié)果可信。改進(jìn)后人參中皂苷類(lèi)成分含量測(cè)定方法中供試品溶液制備方法簡(jiǎn)單、適用,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好,為人參科學(xué)的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

人參藥材購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)(三批樣批號(hào)分別是1:140201CP390,2:301002041,3:20140416,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系張貴君教授鑒定為人參Panax ginseng C.A.Mey),甲醇、三氯甲烷、正丁醇、乙醇(分析純,北京化工試劑廠(chǎng)),乙腈(色譜純,塞默飛世爾科技有限公司),水(娃哈哈純凈水),人參皂苷Rg1對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào): 110703-201529),人參皂苷Re對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110754-201324),人參皂苷Rb1對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào): 110704-201424)。

1.2 儀器

Waters 1525-2489高效液相色譜系統(tǒng),Breeze2色譜工作站(美國(guó)Waters公司),Sartorius BT 25S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司),EQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),HH-S2二孔智控水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參照《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)中人參含量測(cè)定項(xiàng)下方法色譜條件。SunFireC18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm),檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm,流速:1.0 mL/min,流動(dòng)相A為乙腈,B為水,按表1中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫,理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1對(duì)照品7.89 mg,人參皂苷Re對(duì)照品8.03 mg和人參皂苷 Rb1對(duì)照品8.61 mg,分別置于10 mL量瓶中,甲醇溶解、稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取人參皂苷Rg1對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5mL,人參皂苷Re對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL和人參皂苷Rb1對(duì)照品儲(chǔ)備液2.3 mL,置于同一10 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.3 供試品溶液制備方法的建立

2.3.1 提取方式考察 (1)藥典方法[2]:取人參藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)1 g,精密稱(chēng)定,置索氏提取器中,加三氯甲烷,加熱回流3小時(shí),棄去三氯甲烷,藥渣揮干溶劑,連同濾紙筒移入100 mL錐形瓶中,精密加入水飽和正丁醇50 mL,密塞,放置過(guò)夜,超聲處理30分鐘,過(guò)濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?轉(zhuǎn)溶至5mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,過(guò)0.45μm微孔濾膜,即得。

(2)回流提取:取人參藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)1 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,稱(chēng)定重量,加熱回流2小時(shí),取出,密塞,放冷,補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過(guò)濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?轉(zhuǎn)溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,過(guò)0.45μm微孔濾膜,即得。

(3)超聲處理:取人參藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)1 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,稱(chēng)定重量,超聲處理1小時(shí),取出,密塞,放冷,補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過(guò)濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?轉(zhuǎn)溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,過(guò)0.45μm微孔濾膜,即得。

依上述色譜條件,精密吸取對(duì)照品溶液10μL和上述供試品溶液20μL,分別進(jìn)樣分析,測(cè)定色譜峰峰面積,計(jì)算含量。

由表2可見(jiàn),采用回流提取方式,所測(cè)人參皂苷Rg1,人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量最高,故確定提取方式為回流提取。

表2 提取方式考察結(jié)果

2.3.2 提取溶劑考察 取人參藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)1 g,精密稱(chēng)定,置具錐形瓶中,分別精密加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇和乙醇50 mL,密塞,稱(chēng)定重量,加熱回流2小時(shí),取出,補(bǔ)足減失的重量,過(guò)濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘?jiān)謩e加甲醇、70%甲醇、50%甲醇和乙醇溶解,轉(zhuǎn)溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,過(guò)0.45μm微孔濾膜,即得。

由表3可見(jiàn),以70%甲醇作為提取溶劑,所測(cè)人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1含量高于其他提取溶劑結(jié)果,故選擇提取溶劑為70%甲醇。

表3 提取溶劑考察結(jié)果

2.3.3 提取時(shí)間考察 取人參藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)1 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,分別精密加入70%甲醇50 mL,稱(chēng)定重量,加熱回流1小時(shí),1.5小時(shí),2小時(shí),2.5小時(shí),3小時(shí),取出,放冷,補(bǔ)足減失的重量,過(guò)濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘?jiān)?0%甲醇溶解,轉(zhuǎn)溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,過(guò)0.45μm微孔濾膜,即得。

由表4可見(jiàn),加熱回流2.5小時(shí)后人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1總含量基本不再增加,故選用2.5小時(shí)作為提取時(shí)間。

表4 提取時(shí)間考察結(jié)果

2.3.4 溶劑倍量考察 取人參藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)1 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,分別精密加入70%甲醇30 mL(30倍量),40 mL(40倍量),50 mL (50倍量),60 mL(60倍量),稱(chēng)定重量,加熱回流2.5小時(shí),取出,補(bǔ)足減失的重量,過(guò)濾,分別取續(xù)濾液15 mL、20 mL、25 mL、30 mL置蒸發(fā)皿中蒸干,殘?jiān)?0%甲醇溶解,轉(zhuǎn)溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,過(guò)0.45μm微孔濾膜,即得。

表5數(shù)據(jù)說(shuō)明,采用50倍和60倍70%甲醇提取,所測(cè)人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1總含量基本相當(dāng),故選擇50倍作為提取倍量。

表5 溶劑倍量考察結(jié)果

綜上,人參中皂苷類(lèi)成分含量測(cè)定供試品溶液制備最佳方法為:取人參藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)1 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,密塞,稱(chēng)定重量,加熱回流2.5小時(shí),取出,密塞,放冷,補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過(guò)濾,取續(xù)濾液25 mL,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?轉(zhuǎn)溶至5 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,過(guò)0.45μm微孔濾膜,即得。

2.4 樣品測(cè)定

取市售三批人參藥材樣品,按樣品供試品溶液制備方法制備,測(cè)定色譜峰峰面積,計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 三批樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 提取方式選擇

通過(guò)比較藥典方法、回流提取和超聲處理的含量測(cè)定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)藥典方法測(cè)定結(jié)果明顯偏低。采用回流提取不僅可以縮短樣品處理時(shí)間,省去氯仿除雜環(huán)節(jié),節(jié)省有機(jī)溶劑,減少實(shí)驗(yàn)步驟,同時(shí)可以提高人參皂苷提取率,保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。

3.2 提取溶劑選擇

比較甲醇溶液提取與乙醇溶液提取的含量測(cè)定結(jié)果,乙醇提取率明顯較低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取率略高于50%甲醇溶液提取率,且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),采用50%甲醇作為提取溶劑,提取得到的水溶性雜質(zhì)較多,故選擇提取溶劑為70%甲醇溶液。

3.3 提取時(shí)間選擇

比較1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)和3小時(shí)回流提取含量測(cè)定的結(jié)果,人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量基本不變,人參皂苷Rb1的含量隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯增加,2.5小時(shí)后基本不再增加,故選2.5小時(shí)作為提取時(shí)間。

3.4 溶劑倍量選擇

實(shí)驗(yàn)中采用50倍量和60倍量70%甲醇提取時(shí),人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1總含量大致相同,考慮節(jié)省成本,本實(shí)驗(yàn)采用50倍量70%甲醇提取。

此外,研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)采用本方法處理樣品,人參皂苷提取率會(huì)明顯增加,若以此法測(cè)定人參中人參皂苷的含量,其含量限度的制訂尚待進(jìn)一步深入研究。

[1] 徐靜,賈力,趙余慶.人參的化學(xué)成分與人參產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2011,34(3):199-203.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:8.

[3] 曲帥.人參有效活性成分的提取分離及含量測(cè)定[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2013.

[4] 楊雨,鄭斯文,金銀萍,等.人參皂苷的提取分離方法研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(5):214-217.

[5] 喬雪,李月茹.黑參中7種人參皂苷含量測(cè)定[J].人參研究, 2012,24(1):10-12.

Im provement in determ ination method for Ginsenosides in Ginseng

GUO Feng-xia,CHEN Lu-xiao, LIU Bin,et al.School ofChinese Pharmacy,Beijing University ofChinese Medicine,Beijing 100102,China Corresponding author:JIANG Yan-yan,E-mail:jyyjm1129@163.com

Objective To improve the determination method of ginsenoside Rg1,ginsenoside Reand ginsenoside Rb1in ginseng.M ethods Four factors including extraction method,extraction solvent, solvent volume and extraction time were studied through single-factor testmethod.And HPLCmethod was adopted to analyze the determination results of ginsenoside Rg1,ginsenoside Re and ginsenoside Rb1. Results The best sample preparation conditions for the content determination of ginsenosides were 50 times 70%methanol,reflux extraction and duration of 2.5 h.Conclusions The improved method is simple,accurate,and reproduciblewhich could supply a bettermethod for the contentdetermination ofginsenosides.

Ginsenosides; Determination; Improvement

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.10.001

2015-05-28)

(本文編輯:董歷華)

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[郭鳳霞(碩士研究生)、陳路曉(碩士研究生)、劉斌、姜艷艷]

郭鳳霞(1990-),女,2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: gfx521713@163.com

姜艷艷(1980-),女,博士,副教授。研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制方法研究。E-mail: jyyjm1129@163.com