邵麗，王曉，滕振勇（棗莊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東棗莊277100）

HPLC-柱后光化學(xué)衍生法檢測花生醬中黃曲霉毒素

邵麗，王曉，滕振勇
（棗莊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東棗莊277100）

摘要：建立高效液相色譜-在線柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測器檢測花生醬中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。樣品以乙腈-水（80∶20）溶液提取，經(jīng)免疫親和柱凈化后，利用在線柱后光化學(xué)衍生-HPLC-FLD進(jìn)行分析測定。結(jié)果：在優(yōu)化條件下，黃曲霉毒素B1、G1在0.30 mg/L～10 mg/L，黃曲霉毒素B2、G2在0.06 mg/L～3.0mg/L線性關(guān)系良好，r＞0.998，回收率80%～101%，RSD＜5.9%。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測限（LOD）分別為0.10、0.03、0.15、0.04μg/kg。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素；花生醬；在線光化學(xué)衍生；高效液相色譜

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）主要是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）產(chǎn)生的一類在自然界中廣泛存在的真菌毒素，較為常見的有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。黃曲霉毒素能使人體或動(dòng)物的免疫功能喪失，對(duì)人體和動(dòng)物具有強(qiáng)烈致畸、致癌和致突變作用，1993年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物。因此，世界各國都對(duì)食品中的黃曲霉毒素的含量做出了嚴(yán)格的規(guī)定[1-3]。2000年以來我國出口花生和玉米連續(xù)多次由于黃曲霉毒素含量超標(biāo)而被歐盟額外實(shí)施特檢甚至拒絕進(jìn)口，無論是黃曲霉毒素毒性的嚴(yán)重性還是國際貿(mào)易的緊迫性，都說明選擇合適的黃曲霉毒素檢測方法是一個(gè)亟待解決的重要問題。

目前檢測黃曲霉毒素常用的方法有高效液相色譜．熒光檢測法（HPLC-LD）、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。由于AFB1和AFG1分子二呋喃結(jié)構(gòu)中碳碳雙鍵吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)，致使分子熒光強(qiáng)度減弱，影響方法靈敏度和檢出限，通過對(duì)雙鍵衍生變成飽和碳碳單鍵可增強(qiáng)AFB1和AFG1熒光強(qiáng)度。目前黃曲霉毒素有2種衍生方法，即柱前衍生法和柱后衍生法。柱前衍生法主要有三氟乙酸法和稀鹽酸法，柱后衍生法主要有電化學(xué)衍生法、溴法和碘法、三氟乙酸法及光化學(xué)衍生法[4-7]。

柱后光化學(xué)衍生反應(yīng)原理是利用環(huán)狀化合物在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光這一特性，通過紫外光使流動(dòng)相中光解出光子，與AFB1和AFG1分子上的活性雙鍵發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了熒光特性更強(qiáng)且更穩(wěn)定的物質(zhì)，解決了AFB1和AFG1在水溶液中的熒光淬滅現(xiàn)象[8]。

本文采用柱后光化學(xué)衍生，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確、簡單的檢測方法測定花生醬中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，以適應(yīng)出入境檢驗(yàn)檢疫事業(yè)的需要。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，配備熒光檢測器）：安捷倫；AURA INDUSTRIES光化學(xué)衍生器（15 m衍生線圈，254 nm紫外燈衍生光源）、Afla Test-P黃曲霉毒素免疫親和柱、1.5 μm玻璃纖維濾紙：美國VICAM公司；PT1600E型高速均質(zhì)攪拌器：德國Polytron公司；N-EVAP112型干式氮吹儀：美國Organomation公司。

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度分別為1.0、0.3、1.0、0.3 mg/L）：美國SUPELCO公司；甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；PBS稀釋液的配制：準(zhǔn)確稱取氯化鈉8.0 g、磷酸氫二鈉1.2 g、磷酸二氫鉀0.2 g、氯化鉀0.2 g，用990 mL純水溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，純水稀釋至1 000 mL。

1.2色譜條件

C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），流動(dòng)相甲醇-水（45∶55），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量50 μL，柱溫箱30℃。檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

1.3樣品提取

準(zhǔn)確稱花生醬25.0 g，加入NaCl 5 g和乙腈-水（80∶20）125 mL，用高速均質(zhì)攪拌器（28 000 r/min）攪拌3 min，過濾，量取濾液10 mL，加入PBS 40 mL溶液稀釋，混勻后用玻璃微纖維濾紙過濾，取濾液備用。

1.4免疫親和柱凈化

量取濾液15 mL通過免疫親和柱，上樣前要讓柱子里的保護(hù)液完全流盡，樣品過柱時(shí)不要加壓，依靠重力過柱，盡量使樣品過柱子的流速放慢，讓樣品中的毒素有足夠的時(shí)間和親和柱里面的抗體充分接觸并結(jié)合在一起。然后用2×10 mL純凈水淋洗柱子，清洗過程要加壓，加快流速，棄去淋洗液。最后用2 mL色譜乙腈洗脫毒素，收集洗脫液。洗脫時(shí)，一定使用純乙腈。充分溫育至少2 min～5 min。將加入的乙腈分2次～3次加入，洗脫不可加壓，流速液一定要放緩。

1.5樣品檢測

將上述毒素洗脫液50℃氮吹至干，用1 mL流動(dòng)相溶解殘留物，過0.45 μm有機(jī)濾膜，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣50 μL。按1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果與討論

免疫親和柱是由含有B1、B2、G1、G2 4種黃曲霉毒素的單克隆抗體及其附著載體填充而成的，它是利用免疫化學(xué)反應(yīng)原理，能夠特異地選擇吸附樣品提取液中的4種黃曲霉毒素，使其與其他雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等）分離，然后用水將未被免疫親和柱吸附的雜質(zhì)洗脫，最后再用極性強(qiáng)的溶劑（通常用甲醇）把黃曲霉毒素洗脫下來。由于抗原-抗體反應(yīng)具有高特異性、高選擇性的特點(diǎn)，因此凈化效果好，檢測靈敏度高，而且操作簡單，快速，省去了大多數(shù)方法所采用的多次溶劑萃取凈化步驟，節(jié)省了分析時(shí)間。

2.1提取體系的優(yōu)化

黃曲霉毒素檢測一般最常用的提取溶劑為甲醇-水溶液，不同比例的氯仿-水溶液和乙腈-水溶液也可作為提取黃曲霉毒素的溶劑系統(tǒng)。本研究對(duì)提取體系進(jìn)行了優(yōu)化選擇，分別選用乙腈/水（80+20，體積比）、甲醇/水（60+40，體積比）兩種提取溶劑；2∶1、4∶1、6∶1三種溶劑/試樣比（mL/g）；振蕩與高速均質(zhì)兩種提取方式進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果顯示以乙腈/水（80+20）作為提取劑，以4∶1（mL/g）的溶劑/試樣比，以高速均質(zhì)3 min為提取方式的提取體系效果最為理想。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

取適量黃曲霉毒素對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇∶苯（2∶98）稀釋得濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0 μg/mL的對(duì)照品溶液，過0.45 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)樣檢測。以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Table 1　Regression equations，correlation coefficients，linear rang of aflatoxins

2.3最低檢測限和定量限

將黃曲霉毒素混合儲(chǔ)備液稀釋至較低濃度，根據(jù)信噪比S/N=3和S/N=10時(shí)相應(yīng)的濃度確定被測物質(zhì)的最低檢測限和定量限，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的檢測限分別為0.10、0.03、0.15、0.04 μg/kg，定量限分別為0.30、0.10、0.40、0.10 μg/kg。

2.4精密度和重復(fù)性試驗(yàn)

配制濃度分別為0.1、0.05、0.1、0.05 μg/mL的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面積的RSD分別為0.52%、0.69%、2.11%、1.63%、表明儀器精密度良好。

取陰性樣品添加黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4項(xiàng)下方法平行制備6份樣品溶液，進(jìn)樣檢測，記錄峰面積。計(jì)算6份樣品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面積的RSD<5.20%。

2.5回收率試驗(yàn)

本方法的回收率試驗(yàn)是在未檢出黃曲霉毒素的花生醬中，添加黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為如下。AFB1，AFG1的3個(gè)添加水平分別為10.0、5.0、1.0 μg/kg，AFB2和AFG2的3個(gè)添加水平分別為3.0、1.5、0.3 μg/kg。按照1.4制備供試品溶液，分析測定，結(jié)果見表2。

表2　樣品中黃曲霉毒素回收率（n=3）Table 2　Recoveries of aflatoxins in samples（n=3）

2.6柱后光衍生熒光-檢測色譜圖

黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和花生醬加標(biāo)處理后，HPLC-柱后光衍生-熒光檢測的分析結(jié)果如圖1所示。

圖1　AFT混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）和花生醬加標(biāo)樣品（b）的色譜圖Fig.1　Chromatogram of a mixture of standards（a）and a peanut butter sample（b）spiked with AFT

由圖1可知，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2與相鄰峰的分離度均大于1.5。

3　結(jié)論

采用免疫親和柱法結(jié)合柱后電化學(xué)衍生高效液相色譜法，檢測花生醬中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，方法的檢出限分別為0.10、0.03、0.15、0.04 μg/kg，定量限分別為0.30、0.10、0.40、0.10 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.70%～5.28%，回收率80%～101%。該方法采用免疫親和柱吸附試樣中的雜質(zhì)，凈化操作一步完成，采用柱后光照衍生，操作簡單，為黃曲霉毒素的檢測提供一套簡單易行、高靈敏度的檢測方案，適用于出入境工作中大批量花生醬樣品的檢測需要。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.036

收稿日期：2014-06-12

作者簡介：邵麗（1982—），女（漢），工程師，碩士研究生，主要從事出入境食品檢測工作。

Determination of Aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in Peanut Butter by HPLC with On-Line Post-Column Photochemical Derivatization

SHAO Li，WANG Xiao，TENG Zhen-yong
（Zaozhuang Exit-Entry Inspection and Quarantine Burau，Zaozhuang 277100，Shandong，China）

Abstract：To determine the contents of aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in peanut butter using on-line post-column photo-chemical derivatization-HPLC-FLD method.The samples were extracted with acetonitril-H2O（80∶20）and purified with inmunoafinity column，aflatoxins were analyzed by HPLC-FLD with post-column photochemical derivatizaton.On optimum conditions，aflatoxin B1，G1 ranging 0.30 mg/L-10 mg/L showed a good linear relationship with aflatoxin B2，G2 ranging 0.06 mg/L-3.0mg/L with r＞0.998．The recoveries ranged between 80%and 101%，with RSDs all bellow 5.9%．LOD of aflatoxin B1，B2，G1 and G2 were 0.10，0.03，0.15，0.04 μg/kg，respectively.

Key words：aflatoxins；peanut butter；on-line photochemical derivatization；HPLC