錢希穎，金立德，曹 霞

（1.云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，昆明 530100；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，昆明 650101）

近年來炎性反應(yīng)在癲癇發(fā)病中的作用逐漸被人們所認(rèn)識［1］。趨化因子因其在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用并參與癲癇發(fā)作及癲癇病理過程而受到人們關(guān)注［2－3］。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子及其受體不僅廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS），而且參與多種CNS病變，如阿爾茲海默癥、多發(fā)性硬化、艾滋病性癡呆等疾病［4－7］，臨床和大量動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分趨化因子及其受體參與了癲癇發(fā)病過程［8－12］，其中本文作者參與的課題研究在2007年報(bào)道過趨化因子受體CCR10在Swiss小鼠癲癇發(fā)病中的可能作用［13］，但目前暫無CCR10及其配體CCL27、CCL28在癲癇外周血中的表達(dá)變化的報(bào)道。本文通過研究CCL27、CCL28及CCR10在毛果云香堿致癲癇小鼠急性期外周血中的表達(dá)變化，探討其在癲癇發(fā)病急性期可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 昆明Swiss小鼠由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，小鼠的年齡控制在2個月左右［（60±5）d］，體質(zhì)量20～25g，雌雄不拘。誘導(dǎo)前記錄每只實(shí)驗(yàn)小鼠的年齡、性別和體質(zhì)量，對小鼠編號并按照隨機(jī)數(shù)字表法分組（分為4個不同時(shí)間處理組：癲癇發(fā)作10min、30min、1h及2h，每組有6只老鼠建模成功，于每個時(shí)間點(diǎn)設(shè)立對照組）。按照分組，Swiss小鼠分別在毛果云香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)中（during pilocarpine induced status epilepticus，DPISE）或毛果云香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)后（after pilocarpine induced status epilepticus，APISE）不同時(shí)間點(diǎn)處死。所有動物實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格遵守云南實(shí)驗(yàn)動物關(guān)懷和使用健康指南研究所的相關(guān)規(guī)定，在整個實(shí)驗(yàn)過程中，在操作上盡量避免對動物的傷害。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材及實(shí)驗(yàn)藥品 低溫冷凍切片機(jī)（HM505E，Microm，Germany）；分光光度儀（NanoDrop，USA）；LightCycler 2.0Instrument（Roche，Germany）；mRNA 的微量提取試劑盒及一步法PCR試劑盒購自Qiagen公司（Valencia，CA，USA）；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL－2000購自大連寶生物公司；毛果云香堿和硝酸甲基東莨菪堿購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 癲癇小鼠模型的建立 毛果云香堿誘發(fā)癲癇小鼠模型的建立：48只小鼠依照文獻(xiàn)［14－16］方法所述操作進(jìn)行毛果云香堿誘發(fā)癲癇處理。具體操作步驟為：誘導(dǎo)前30min，每只小鼠腹部皮下注射硝酸甲基東莨菪堿1mg／kg。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射毛果云香堿300mg／kg，對照組給予腹腔注射0.9%NaCl溶液0.1mL，將小鼠1只／籠分開，并放置在安靜、光線較暗的實(shí)驗(yàn)間以避免相互激惹和聲音刺激。仔細(xì)觀察和記錄動物的反應(yīng)并計(jì)時(shí)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量熒光PCR（Real－time PCR）半定量檢測 取小鼠正常及癲癇急性期不同時(shí)間點(diǎn)（10min、30min、1h、2h）外周血，每組12只，共48只，按照mRNA的微量提取試劑盒及一步法PCR試劑盒說明書提取外周全血mRNA，置于－80℃?zhèn)溆?；SYBR GreenⅠ雙鏈DNA結(jié)合染料用于Real－time PCR檢測，以突觸素作為參照基因，檢測CCL27、CCK28mRNA表達(dá)量（引物序列見表1）。所有反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)總體積為20μL，包括5μL的cDNA，2μL引物混合物（每種引物濃度為10μmol／L），4μL SYBR GreenⅠ，9μL SYBR Green水，混和后，在LightCycler中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃10 min；94℃1s，60℃6s，72℃10s，45個循環(huán)；最后冷卻至4℃。熱啟動PCR方法用于防止不完整的DNA變性，擴(kuò)增后的實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物從毛細(xì)反應(yīng)管甩下后，5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠上分離電泳，溴化乙錠染色后在紫外光下觀察。用CCL27、CCL28基因表達(dá)量與突觸素的表達(dá)量比值表示CCL27、CCL28的相對表達(dá)量。

表1 目的基因引物序列

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 取正常及癲癇急性期不同時(shí)間點(diǎn)（10 min、30min、1h、2h）肝素抗凝外周血（實(shí)驗(yàn)組：每組3只，共12只；對照組：每組3只，共12只?？傆?jì)24只），加淋巴細(xì)胞分離液2mL，1500r／min離心5min，提取淋巴細(xì)胞層，再以磷酸鹽緩沖液（PBS）2mL漂洗后離心3次，去除上清液后用70%乙醇固定30min。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的人抗鼠單克隆抗體CCR10及陰性對照羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）FITC（法國國際免疫公司）標(biāo)記后的淋巴細(xì)胞分離液，用FACSsort型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測。測試結(jié)果用Cell Qwest Plot（美國BD公司）分析點(diǎn)圖及組方圖，以熒光強(qiáng)度的幾何均數(shù)表示外周血淋巴細(xì)胞中CCR10的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用表示，采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癲癇動物模型的建立 昆明Swiss小鼠在毛果云香堿誘導(dǎo)后（25.8±15.6）min后進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)（凝視逐漸頻繁，間或出現(xiàn)咀嚼運(yùn)動，有大量唾液從口腔流出，逐漸出現(xiàn)點(diǎn)頭運(yùn)動，由前肢劇烈抽搐發(fā)展到后退、向后跌倒和身體旋轉(zhuǎn)，甚至角弓反張），對照組未見癲癇發(fā)作。維持時(shí)間為（6.8±1.8）h，病死率18.2%。在造模中，將約1%小鼠未能成功誘導(dǎo)并剔除。

圖1 癲癇小鼠外周血CCL27、CCL28mRNA表達(dá)

圖2 癲癇小鼠外周血淋巴細(xì)胞CCR10的表達(dá)

2.2 CCL27、CCL28mRNA水平在癲癇小鼠急性期外周血中的表達(dá)檢測 提取昆明Swiss小鼠外周血mRNA，行CCL27、CCL28Real－time PCR 檢測，結(jié)果顯示 CCL27、CCL28mRNA表達(dá)水平在癲癇小鼠發(fā)作2h明顯高于對照組（P＜0.05），見圖1。

2.3 CCR10蛋白在癲癇小鼠外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)檢測用制備好的外周血淋巴細(xì)胞懸液行流式細(xì)胞檢測，結(jié)果顯示CCR10在急性癲癇小鼠發(fā)作2h的外周淋巴細(xì)胞中表達(dá)水平1.67±0.65明顯高于對照組20.86±3.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

3 討 論

炎性細(xì)胞趨化因子是一類相對分子質(zhì)量為8000～14000的小分子家族，根據(jù)其基因組成和N－端2個高度保守半胱氨酸殘基位置不同，可分為C、CC、CXC、CX3C4種亞型，它們能夠趨化不同的炎性細(xì)胞參與急、慢性炎性反應(yīng)以及先天性或獲得性炎性反應(yīng)。趨化因子及其受體介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)在癲癇發(fā)作中的作用正逐漸被人們所認(rèn)識，其在癲癇發(fā)病過程中表達(dá)的異常增高被認(rèn)為是激活和促進(jìn)炎性細(xì)胞向癲癇受損區(qū)聚集的機(jī)制之一。目前CC／CCR、CXC／CXCR、CX3C／CX3CR家族成員均被發(fā)現(xiàn)與癲癇發(fā)病過程相關(guān)［8－12］，趨化因子及其受體在癲癇發(fā)病過程中異常表達(dá)也被證實(shí)與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)［15］。本課題組在前期研究中首次在正常Swiss小鼠海馬組織中檢測到CCR10的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)過程中及發(fā)作后CCR10表達(dá)異常［13］，提示 CCR10及其配體CCL27、CCL28在癲癇發(fā)作中可能發(fā)揮了一定的作用，但它們是否在癲癇發(fā)作急性期外周血中也出現(xiàn)異常表達(dá)變化？目前尚不清楚。本研究利用Real－time PCR方法檢測了毛果云香堿致癲癇小鼠外周血急性期（10min、30min、1h、2h）CCL27、CCL28mRNA的表達(dá)水平，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了外周血淋巴細(xì)胞CCR10的表達(dá)變化，結(jié)果顯示CCL27、CCL28mRNA在毛果云香堿致癇小鼠發(fā)作2h外周血中出現(xiàn)明顯表達(dá)上升（P＜0.05），CCR10在外周淋巴細(xì)胞上的表達(dá)也在2h出現(xiàn)表達(dá)的上調(diào)，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了癲癇發(fā)作早期存在一系列免疫因子表達(dá)的變化，CCR10及其配體CCL27、CCL28的異常表達(dá)也可能與癲癇發(fā)病過程相關(guān)。隨著對趨化因子及其受體在癲癇病理過程中作用的逐步了解，終將闡明免疫炎癥與癲癇的關(guān)系，為癲癇尤其是難治性癲癇的治療提供新的靶點(diǎn)。

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