李 琳，趙朝成，劉其友，劉春爽

(中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580)

Pseudomonas sp. LKY-5產(chǎn)生的表面活性劑提取及其穩(wěn)定性研究

李 琳，趙朝成，劉其友，劉春爽

(中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580)

針對(duì)二苯并噻吩高效降解菌Pseudomonassp. LKY-5降解過程中產(chǎn)生表面活性劑的現(xiàn)象，進(jìn)行碳源優(yōu)化，將提取分離出的表面活性劑進(jìn)行化學(xué)組分分析和理化性質(zhì)測定，考察溫度、pH、無機(jī)離子對(duì)其表面活性穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，花生油為Pseudomonassp. LKY-5產(chǎn)生表面活性劑的最佳碳源，產(chǎn)生的表面活性劑為鼠李糖脂，產(chǎn)量為0.15 gL，臨界膠束濃度(CMC)為180 mgL，親水親油平衡值(HLB)為12.3，對(duì)柴油24 h的乳化能力達(dá)61%。該表面活性劑在溫度30～80 ℃、pH 6～13的條件下表面活性穩(wěn)定，能夠耐受200 gL的NaCl或MgCl2以及20 gL的CaCl2，穩(wěn)定性能良好。

假單胞菌 生物表面活性劑 鼠李糖脂 穩(wěn)定性

近年來，隨著國內(nèi)高硫原油進(jìn)口量的迅速增長，在運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及加工過程中不可避免地對(duì)土壤、地下水和海洋環(huán)境造成嚴(yán)重污染。二苯并噻吩(DBT)是一種具有綜合多芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的含硫雜環(huán)化合物，是高硫原油的重要組成，具有致癌性和生物富集性，難以被微生物降解[1-2]。二苯并噻吩的生物可利用性低是限制其微生物降解的主要因素，表面活性劑可以增強(qiáng)其在水相基質(zhì)的溶解，強(qiáng)化與微生物間的質(zhì)量傳遞[3]。生物表面活性劑是由細(xì)菌、酵母菌和真菌在代謝過程中分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如糖脂、多糖脂、脂肽、脂蛋白以及中性類脂衍生物等。與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑具有低毒、選擇性好、可原位生長和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因而非常適合應(yīng)用在環(huán)境污染治理領(lǐng)域[4-5]。利用生物表面活性劑或其產(chǎn)生菌強(qiáng)化環(huán)境中難降解污染物的生物降解已成為目前的研究熱點(diǎn)[6]。Pedetta等[7]利用可產(chǎn)生表面活性劑的假單胞菌來提高菲的生物利用性，在72～168 h對(duì)菲的降解率可以達(dá)到75%～100%。Singh等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)生物表面活性劑的濃度和咔唑的降解速率成正比。本課題選用前期篩選得到的二苯并噻吩高效降解菌Pseudomonassp. LKY-5[9]，針對(duì)其在降解過程中產(chǎn)生表面活性劑的現(xiàn)象，進(jìn)行碳源優(yōu)化，提取并分析其產(chǎn)生的表面活性劑，研究溫度、pH、無機(jī)離子對(duì)其穩(wěn)定性的影響，為應(yīng)用生物表面活性劑產(chǎn)生菌強(qiáng)化石油污染土壤的生物修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HPO40.6 g，KH2PO40.2 g，NaNO34.0 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO40.01 g，MgSO40.3 g，酵母膏0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，加入不同碳源(甘油、花生油、液體石蠟等)，其中花生油為市售食用油，呈淡黃透明狀，密度(30 ℃)0.908 g/cm3，運(yùn)動(dòng)黏度(20 ℃)82.56 mm2/s，含不飽和脂肪酸(80%)以及軟脂酸、硬脂酸和花生酸等飽和脂肪酸(20%)。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g(固體培養(yǎng)基用)，pH 7.2～7.5。

將培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌20 min，不適合高溫高壓滅菌的藥品需要經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

1.1.2 菌種來源 從勝利油田石油污染土壤中分離篩選出二苯并噻吩高效降解菌Pseudomonassp. LKY-5，經(jīng)LB培養(yǎng)基富集后，用無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基制成菌懸液，菌含量為2.9×108CFU/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 碳源優(yōu)化 分別在100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種2 mL的甘油、0號(hào)柴油、液體石蠟、正十六烷、花生油、20 g/L葡萄糖、100 mg/L DBT作為碳源，于搖床160 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)72 h后，在室溫下采用EasyDyne型表面張力儀(德國KRUSS)板法測定發(fā)酵液的表面張力。

1.2.2 表面活性劑的提取、分離及薄層色譜(TLC)分析 將培養(yǎng)72 h的發(fā)酵液在8 000 r/min、4 ℃下離心20 min，將上清液用6 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，放入4 ℃的冰箱中過夜，然后加入等體積氯仿/甲醇(2∶1)混合液萃取2次，合并有機(jī)相，用無水Na2SO4干燥后，在40 ℃下減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，得到淺黃色漿狀物，將其在冷阱溫度-54 ℃、壓力5～10 Pa的條件下冷凍干燥，得到表面活性劑粗產(chǎn)物。

取0.1 g粗產(chǎn)物溶于1 mL氯仿中，點(diǎn)樣于硅膠G板進(jìn)行TLC分析，展開后，噴灑顯色劑于100 ℃下加熱3～6 min。展開劑為氯仿/甲醇/乙酸(體積比96∶4∶0.5)，顯色劑為α-萘酚試劑(1.59 g α-萘酚溶于51 mL無水乙醇和4.6 mL 18 mol/L H2SO4)。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源優(yōu)化

圖1 不同碳源對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響■—空白； ■—發(fā)酵液

碳源是菌株生長和合成表面活性劑的能量來源，對(duì)生物表面活性劑的產(chǎn)量和特性有重要影響[10]。不同碳源對(duì)Pseudomonassp. LKY-5產(chǎn)生的表面活性劑特性的影響如圖1所示。從圖1可以看出：以甘油、液體石蠟、正十六烷、葡萄糖、二苯并噻吩(DBT)為碳源時(shí)，發(fā)酵液的表面張力降低不明顯，均在50 mN/m以上；以柴油和花生油作為碳源時(shí)，發(fā)酵液表面張力明顯降低，尤其是以花生油作為碳源時(shí)，發(fā)酵液的表面張力能夠降至28.9 mN/m，有利于生物表面活性劑的產(chǎn)生。原因可能是油性基質(zhì)相比水溶性基質(zhì)更能誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生表面活性劑，而葡萄糖所產(chǎn)生的分解代謝物會(huì)遏制某些適應(yīng)性酶的合成[11-12]。

2.2 表面活性劑的化學(xué)組分分析及其理化性質(zhì)測定

2.2.1 表面活性劑的化學(xué)組分分析 以氯仿/甲醇/乙酸(體積比96∶4∶0.5)為展開劑，將氯仿提取的粗產(chǎn)物在硅膠G板上展開后，顯色反應(yīng)表明在Rf=0.56處出現(xiàn)淡橙黃色的斑點(diǎn)，對(duì)鼠李糖脂顯色劑(α-萘酚試劑)呈正反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)樣品點(diǎn)和鼠里糖脂純品點(diǎn)的Rf值相同，對(duì)萘酚試劑都有顯色反應(yīng)，進(jìn)一步結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)假單胞菌產(chǎn)生的表面活性劑基本是鼠李糖脂的報(bào)道[8，12]，初步將Pseudomonassp. LKY-5產(chǎn)生的表面活性劑定性為鼠李糖脂。

2.2.2 表面活性劑的理化性質(zhì) 經(jīng)過提取、分離和冷凍干燥后獲得的表面活性劑粗產(chǎn)物為淡黃色固體粉末，產(chǎn)量為0.15 g/L。不同濃度表面活性劑的表面張力變化曲線如圖2所示。從圖2可以看出，隨著表面活性劑濃度的增加，溶液的表面張力迅速降低，但隨著表面活性劑濃度的進(jìn)一步增加，溶液的表面張力趨于穩(wěn)定值(28.9 mN/m)，經(jīng)作圖求得臨界膠束濃度(CMC)為180 mg/L，遠(yuǎn)低于十二烷基硫酸鈉的CMC(2 200 mg/L)[13]。

圖2 不同濃度表面活性劑的表面張力

一般認(rèn)為親水親油值(HLB)在8～18范圍內(nèi)的表面活性劑可以作為乳化增溶劑[12]。經(jīng)測定該生物表面活性劑的HLB為12.3，表明其可以對(duì)疏水性物質(zhì)起到增溶作用。乳化性能是表面活性劑的另一個(gè)重要指標(biāo)。表1為濃度1 000 mg/L的該表面活性劑溶液對(duì)液體石蠟和柴油的乳化能力，同時(shí)以相同濃度的陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液作為對(duì)比。從表1可看出，該表面活性劑溶液對(duì)柴油和液體石蠟的乳化能力均較SDS水溶液差，對(duì)柴油的乳化能力則優(yōu)于液體石蠟，對(duì)柴油24 h的乳化能力達(dá)到61%，120 h后還可以保持在56%，乳化相較為穩(wěn)定。

表1 Pseudomonas sp. LKY-5產(chǎn)生的表面活性劑的乳化能力 %

2.3 表面活性劑的穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度對(duì)表面活性劑穩(wěn)定性的影響 溫度對(duì)表面活性劑穩(wěn)定性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，經(jīng)過30～80 ℃的熱處理后表面活性劑的表面張力沒有明顯變化。Pseudomonassp. LKY-5產(chǎn)生的表面活性劑能夠耐受80 ℃高溫1 h而不失活，說明其對(duì)高溫具有較強(qiáng)的耐受性，具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 溫度對(duì)表面活性劑穩(wěn)定性的影響

2.3.2 pH對(duì)表面活性劑穩(wěn)定性的影響 圖4為pH對(duì)表面活性劑溶液表面張力的影響。由圖4可以看出：表面活性劑溶液的表面張力受pH影響較大；當(dāng)pH<6時(shí)，表面活性劑溶液渾濁而不穩(wěn)定，表面張力隨著pH的降低而迅速增大；當(dāng)6

圖4 pH對(duì)表面活性劑穩(wěn)定性的影響

2.3.3 無機(jī)離子對(duì)表面活性劑穩(wěn)定性的影響 不同濃度的NaCl，CaCl2，MgCl2對(duì)該生物表面活性劑穩(wěn)定性的影響見圖5。由圖5可以看出：NaCl、MgCl2在10～200 g/L范圍內(nèi)對(duì)表面活性劑表面張力的影響較小，表面張力基本穩(wěn)定在30 mN/m；當(dāng)添加20 g/L以下的CaCl2時(shí)，表面張力可以保持在35 mN/m左右，但隨著CaCl2濃度的增加，該表面活性劑溶液的表面張力明顯上升。與梁生康[12]對(duì)銅綠假單胞菌O-2-2產(chǎn)生的鼠李糖脂溶液的研究結(jié)果相比(可耐受60 g/L 的NaCl，5 g/L 的MgCl2以及2 g/L的CaCl2)，該表面活性劑對(duì)鹽離子的耐受性能較好。這可能是因?yàn)椴煌戤a(chǎn)生的鼠李糖脂的組分不完全一樣，所以對(duì)鹽離子的適應(yīng)程度不同。

圖5 無機(jī)離子對(duì)表面活性劑穩(wěn)定性的影響●—MgCl2； ▲—CaCl2； ■—NaCl

3 結(jié) 論

(1) 花生油相比其它碳源更加適合Pseudomonassp. LKY-5產(chǎn)生表面活性劑，可以將發(fā)酵液表面張力降至28.9 mN/m，表面活性劑的產(chǎn)量為0.15 g/L。

(2) 經(jīng)化學(xué)組分分析將Pseudomonassp. LKY-5產(chǎn)生的表面活性劑定性為鼠李糖脂，其CMC為180 mg/L，HLB為12.3；乳化性能比十二烷基硫酸鈉差，對(duì)柴油的乳化能力優(yōu)于液體石蠟，對(duì)柴油24 h的乳化能力達(dá)到61%，120 h后仍可保持在50%以上。

(3)Pseudomonassp. LKY-5產(chǎn)生的表面活性劑可以耐受80 ℃的高溫，在pH 6～13范圍內(nèi)保持良好的表面活性，添加200 g/L以下的NaCl或MgCl2以及20 g/L以下的CaCl2時(shí)其表面張力基本不變。該表面活性劑在高溫、高pH、高鹽度等極端環(huán)境下仍具有很好的表面活性和穩(wěn)定性能，可以進(jìn)一步應(yīng)用于強(qiáng)化鹽堿地區(qū)石油污染土壤的生物修復(fù)。

[1] Eastmond D A，Booth G M，Lee M L.Toxicity， accumulation， and elimination of polycyclic aromatic sulfur heterocycles in Daphnia magna[J].Arch Environ Contam Toxicol，1984，13：105-111

[2] Mezcua M，Boltes K，Leton P，et al.Determination of PASHs by various analytical techniques based on gas chromatography-mass spectrometry：Application to a biodesulfurization process[J].Talanta，2008，75(5)：1158-1166

[3] 梁生康，王修林，單寶田，等.生物表面活性劑強(qiáng)化疏水性有機(jī)污染物生物降解研究進(jìn)展[J].化工環(huán)保，2005，25(4)：276-280

[4] 牛明芬，李鳳梅，韓曉日，等.生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及表面活性劑穩(wěn)定性研究[J].生態(tài)學(xué)雜志，2005，24(6)：631-634

[5] 花莉，洛晶晶，胡陽陽，等.產(chǎn)表面活性劑石油降解菌株的篩選及鑒定[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，32(1)：34-38

[6] Christofi N，Ivshina I B.Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation[J].Journal of Applied Microbiology，2002，93(6)：915-929

[7] Pedetta A，Pouyte K，Herrera Seitz M K，et al.Phenanthrene degradation and strategies to improve its bioavailability to microorganisms isolated from brackish sediments[J].International Biodeterioration & Biodegradation，2013，84：161-167

[8] Singh G B，Gupta S，Gupta N.Carbazole degradation and biosurfactant production by newly isolatedPseudomonassp. strain GBS.5[J].International Biodeterioration & Biodegradation，2013，84：35-43

[9] Li Lin，Zhao Chaocheng，Liu Qiyou，et al.Optimization for the microbial degradation of dibenzothiophene byPseudomonassp.LKY-5 using response surface methodology[J].China Petroleum Processing and Petrochemical Technology，2014，16(1)：19-26

[10]余焱，張志堅(jiān)，宋柏函，等.一株高效生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離、鑒定及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，51(4)：501-506

[11]孫燕，洪青，李順鵬.一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離及其特性研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009，36(8)：1110-1116

[12]梁生康.鼠李糖脂生物表面活性劑對(duì)石油烴污染物生物降解影響的研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2005

[13]張建華，馮利智，區(qū)尚仁.可見吸收光譜線型參數(shù)分析法測定十二烷基硫酸鈉臨界膠束濃度[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2006，42：885-888

STUDY ON BIOSURFACTANT PRODUCED BY PSEUDOMONAS SP. LKY-5 AND ITS STABILITY

Li Lin， Zhao Chaocheng， Liu Qiyou， Liu Chunshuang

(CollegeofChemicalEngineering，ChinaUniversityofPetroleum(Huadong)，Qingdao，Shandong266580)

ThePseudomonassp. LKY-5 produces biosurfactant during biodegradation process of dibenzothiophene. This work optimizes the carbon sources for biosurfactant production， verifies the biosurfactant by thin-layer chromatography， and then determines its physicochemical properties， and investigates the influence of temperature， pH and inorganic ions on the active stability of biosurfactant. The results show that the biosurfactant produced is rhamnolipid， and peanut oil is the optimal carbon source for the production of biosurfactant with a yield of 0.15 g/L. The critical micelle concentration (CMC) and hydrophile-lipophile balance (HLB) value of biosurfactant are 180 mg/L and 12.3， respectively. Twenty-four hours diesel emulsification ability is 61%. The biosurfactant is stable at conditions of a temperature of 30—80 ℃， a pH of 6—13， and can tolerate the environment of 200 g/L NaCl (or MgCl2) or 20 g/L CaCl2.

Pseudomonas； biosurfactant； rhamnolipid； stability

2014-07-10； 修改稿收到日期： 2014-09-10。

李琳，博士研究生，研究方向?yàn)槭臀廴就寥郎镄迯?fù)。

趙朝成，E-mail：zhaochch@upc.edu.cn。

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No.12CX06043A)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.21307160)。