蔡輝 張蓓蓓 張靜 趙智明 趙凌杰 常文靜 董曉蕾

基礎(chǔ)研究

丹參酮ⅡA對壓力超負(fù)荷大鼠心肌肝細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響

蔡輝 張蓓蓓 張靜 趙智明 趙凌杰 常文靜 董曉蕾

目的 探討丹參酮ⅡA磺酸鈉（STS）對壓力超負(fù)荷大鼠肝細(xì)胞生長因子（HGF）表達(dá)的影響。方法 采用腹主動脈縮窄法制備壓力超負(fù)荷心肌纖維化（MF）模型。SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組，8例）、模型組（Model組，7例）、卡托普利組（Captopril組，7例）、STS高劑量組（STS-H 組，7例）和STS低劑量組（STS-L組，8例）。術(shù)后8周末，測定各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI），觀察心肌病理學(xué)改變，計(jì)算纖維化面積，堿水法檢測羥脯氨酸（HYP）含量，免疫組化分析HGF、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）和組織金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP1）的表達(dá)。結(jié)果 與Model組比較，Captopril組、STS-H組和STS-L組LVMI、心肌HYP含量、CVF及PCVF均有不同程度的降低（P<0.01或P<0.05），心肌MMP9和TIMP1免疫組化染色MOD值顯著下降（P<0.01或 P<0.05），而 MMP9/TIMP1比值顯著升高（P<0.01或 P<0.05）。Captopril組（0.062±0.007）、STS-H組（0.061±0.006）和 STS-L組（0.038±0.005）HGF免疫組化染色 MOD 值較 Model組（0.031±0.005）顯著升高（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論 STS可通過上調(diào)心肌組織HGF的表達(dá)改善壓力超負(fù)荷大鼠的心肌纖維化。

丹參酮ⅡA；壓力超負(fù)荷；心肌纖維化；肝細(xì)胞生長因子

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是以心臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中膠原纖維過量沉積為主的病理改變，是引起各種心律失常和慢性心力衰竭的重要原因。研究表明[1]，肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種高效的生物活性因子，對心臟具有強(qiáng)大的保護(hù)作用。心肌組織局部HGF表達(dá)降低與MF密切相關(guān)，且外源性HGF能通過多種途徑起到抗MF的作用[2]。丹參酮ⅡA是活血化瘀中藥丹參的主要有效成分之一。自錢名堃等人制成水溶性衍生物丹參酮ⅡA磺酸鈉（sodium tanshinoneⅡA sulfonate，STS）以來，對其心血管藥理活性的研究不斷深入，STS注射劑現(xiàn)已廣泛用于冠心病、心絞痛和心肌梗死等心血管疾病的臨床治療。本實(shí)驗(yàn)擬觀察壓力超負(fù)荷MF大鼠局部HGF表達(dá)的變化及STS對其的影響，為MF的防治提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級6周齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（BM）（180±20）g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SYXK（蘇）2003-0032。

1.2 藥品及試劑 STS注射劑（2 ml/10 mg）購自上海第一生化藥業(yè)有限公司，卡托普利片（12.5 mg/片）購自中美上海施貴寶制藥有限公司，基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）、組織金屬蛋白酶抑制劑1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP1）和HGF一抗購自武漢博士德生物公司，辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG二抗、EliVision plus免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，羥脯氨酸測定試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及造模 采用腹主動脈縮窄法制備壓力超負(fù)荷模型。所有大鼠術(shù)前禁食12 h，按照隨機(jī)數(shù)字表法抽取8只作為Sham組，剩下52只作為手術(shù)組。手術(shù)組在腎動脈上方0.5 cm用直徑0.70 mm銀夾夾閉，使腹主動脈縮窄60%～70%；而Sham組僅分離，不夾閉腹主動脈。手術(shù)4周后，將存活的39只手術(shù)組大鼠分為模型組（Model組，n=10）、卡托普利組（Captopril組，n=9）、STS高劑量組（STSH 組，n=10）及 STS低劑量組（STS-L 組，n=10），分別給予生理鹽水（2 ml·kg-1·d-1，腹腔注射）、卡托普利片（100 ml·kg-1·d-1，灌胃）、STS 注射劑（20 ml·kg-1·d-1，腹腔注射）和 STS 注射劑（10 ml·kg-1·d-1，腹腔注射）。Sham 組（n=8）予生理鹽水 2 ml·kg-1·d-1腹腔注射。

1.3.2 心臟質(zhì)量指數(shù)（HMI）檢測 藥物干預(yù)4周后，實(shí)驗(yàn)大鼠共存活37只，死亡10只（其中Model組3只、Captopril組2只、STS-H組3只、STS-L組2只），死亡原因?yàn)閲?yán)重心衰。麻醉完全后打開胸腔，剪取心臟，除去心房及大血管，稱取心臟質(zhì)量（heart mass，HM），分離左右心室，稱取左心室質(zhì)量（left ventricular mass，LVM）。計(jì)算 HMI=HM/BM和LVMI=LVM/BM。透壁剪取左室心尖部分組織投入液氮中，其余標(biāo)本放在4℃的4%多聚甲醛中固定。

1.3.3 左室心肌病理學(xué)分析 心肌標(biāo)本固定24 h后，脫水、石蠟包埋，沿左室長軸線每隔1 mm橫斷面切取數(shù)張厚4 μm的切片，做HE和Masson染色。光鏡下觀察組織形態(tài)，采用專業(yè)圖片分析軟件Image-Pro Plus 6.0測定纖維化面積。以視野中所有藍(lán)色膠原（Masson染色：膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色）面積之和（不包括血管周圍膠原面積）除以心肌纖維和結(jié)締組織面積總和，計(jì)算左心室間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。以血管周圍膠原面積除以血管面積，計(jì)算血管周圍膠原容積分?jǐn)?shù)（perivascular collagen volume fraction，PCVF）。

1.3.4 羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量測定 準(zhǔn)確稱取60 mg心肌組織放入試管中，按照HYP試劑盒說明書以堿水解法提取蛋白，比色法檢測樣品吸光度，按照下式計(jì)算羥脯氨酸含量。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測心肌HGF、MMP9和TIMP1的表達(dá) 心肌切片脫蠟，乙醇梯度脫水，檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。滅活過氧化物酶，加入一抗孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水并封片。光鏡下觀察組織中蛋白的表達(dá)情況，細(xì)胞質(zhì)中黃色為表達(dá)陽性，每張切片隨機(jī)取5個視野拍照。用Image-Pro Plus 6.0測量蛋白表達(dá)的平均光密度（MOD），即陽性累積光密度除以照片總面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。各組均數(shù)間比較采用單因素方差分析（One-Way AVONE）；兩組間均數(shù)比較，方差齊時用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時用Dunnett′s T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMI、LVMI和心肌 HYP含量的比較 與Sham 組相比，Model組HMI、LVMI和心肌HYP含量顯著增高（P<0.01）。與Model組相比，Captopril組、STS-H 組、STS-L 組大鼠 HMI、LVMI和心肌HYP含量均有不同程度的降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠HMI、LVMI和HYP含量比較（±s）

表1 各組大鼠HMI、LVMI和HYP含量比較（±s）

注：HMI：心臟質(zhì)量指數(shù)；LVMI：左心室質(zhì)量指數(shù)；HYP：羥脯氨酸。與 Sham 組相比，aP＜0.01；與 Model組相比，bP＜0.01，cP＜0.05

組別例數(shù)HMI（mg/kg）LVMI（mg/kg）HYP（μg/g）Sham 組 8 2.63±0.13 2.08±0.11 456.95±125.09 Model組 7 3.23±0.25a 2.75±0.20a 858.58±144.95aCaptopril組 7 2.82±0.32b 2.29±0.29b 482.88±29.23bSTS-H 組 7 2.88±0.20b 2.36±0.20b 520.67±174.62bSTS-L 組 8 3.00±0.27c 2.50±0.18c 580.40±174.62c

2.2 心肌病理學(xué)分析 與Sham組比較，Model組大鼠心肌纖維增粗且排列紊亂，間質(zhì)和血管周圍大量藍(lán)色膠原沉積。與Model組比較，Captopril組、STS-H組和STS-L組心肌纖維情況明顯改善，間質(zhì)和血管周圍纖維化面積明顯減少。圖1（左HE染色，右Masson染色）顯示了各組大鼠心肌病理學(xué)改變。經(jīng)過計(jì)算（圖2 A，B），與Sham組比較，Model組CVF和PCVF顯著升高（P<0.05）；與Model組比較，Captopril組、STS-H組和 STS-L組 CVF和PCVF明顯下降（P<0.01）。

2.3 各組大鼠心肌MMP9和TIMP1免疫組化結(jié)果 與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織MMP9和TIMP1陽性表達(dá)區(qū)域明顯增多，半定量分析結(jié)果顯示，二者M(jìn)OD值顯著升高（P<0.01），MMP9/TIMP1值顯著下降（P<0.01）。與Model組比較，Captopril組、STS-H組和STS-L組MMP9和TIMP1陽性表達(dá)區(qū)域減少，MOD值均有所下降（P<0.01），而 MMP9/TIMP 值升高（P<0.01，P<0.05）。見圖3。

3.4 各組大鼠心肌HGF免疫組化結(jié)果 與Sham組比較，Model組大鼠心肌HGF陽性表達(dá)明顯減少，MOD值顯著降低（P<0.01）。與Model組比較，Captopril組、STS-H組和STS-L組心肌HGF陽性表達(dá)呈上升趨勢（P<0.05，P<0.01），MOD 值顯著升高（P<0.01）。見圖4。

3 討論

MF和左心室肥厚是高血壓左室重構(gòu)的主要特點(diǎn)。近年來，活血化瘀中藥抗心室重構(gòu)的作用已越多越多地受到關(guān)注?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，丹參對心血管疾病有良好的療效，TanⅡA作為有效成分之一對防治心室重構(gòu)顯示出明顯的優(yōu)勢。除了通過抑制Ca2+通道改善心室肥厚[3]，丹參酮ⅡA還能通過抗炎、抗氧化、抑制心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblast，CFB）向肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）分化[4]等作用改善MF。我們前期的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[5]。

本實(shí)驗(yàn)采用腹主動脈縮窄法建立壓力超負(fù)荷MF模型，除了通過升高血壓，增加左室射血阻力外，還通過減少腎臟血流、激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，引起手術(shù)組大鼠左室重構(gòu)。手術(shù)8周末，Model組大鼠LVMI顯著增加，提示左心室肥厚的存在，HYP、CVF和CVF水平升高，提示MF模型建立；并且纖維化心肌局部HGF的表達(dá)和MMP9/TIMP1值明顯降低。STS可明顯改善壓力超負(fù)荷大鼠MF和左室肥厚，其療效與陽性對照藥物卡托普利無顯著差別，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，HGF與c-Met受體結(jié)合能防治多個器官的纖維化病變[7,8]。Yi等[9]發(fā)現(xiàn)，HGF/c-Met信號通路對成年小鼠心臟具有保護(hù)作用。心臟發(fā)生損傷時，血漿中HGF水平反饋性升高，一方面抑制心肌細(xì)胞肥大和凋亡[10]，保護(hù)心肌收縮力；另一方面，抑制CFB增殖、分泌和分化，改善心臟舒張功能。Arechederra等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，HGF可以下調(diào)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-平滑肌肌動蛋白在轉(zhuǎn)化生長因子-β1處理過的 CFB的表達(dá)水平。Okayama等[12]報(bào)道，HGF通過抑制冠狀動脈內(nèi)皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變和CFB-MFB分化，分別改善血管周圍纖維化和心肌間質(zhì)纖維化。

ECM對維持左心室形態(tài)和功能至關(guān)重要。MMPs是降解ECM的關(guān)鍵酶，其活性主要受到TIMPs的拮抗。MMP9即明膠酶B，主要水解變性膠原，是參與高血壓左室重構(gòu)重要的MMPs[13]。TIMP1可與MMP9的酶原或活化后酶催化區(qū)的羧基末端以1∶1比例共價結(jié)合，形成復(fù)合體，是MMP9特異性抑制劑，故二者的比值在膠原代謝中的作用顯然更為重要。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，纖維化心肌組織MMP9和TIMP的表達(dá)均上升，但MMP9/TIMP1值降低。Polyakova等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，與心功能正常人比較，擴(kuò)張型心肌病、缺血性心肌病和心肌炎所致心功能Ⅳ級患者心肌MMP9和TIMP1均上升，總MMP/總TIMP也上升，但膠原合成均大于降解，與本研究部分結(jié)果具有一致性。Bonnema等[15]報(bào)道，隨年齡增長，血漿MMP9水平呈下降趨勢，而TIMP1水平呈上升趨勢，故推測年齡因素或許是影響MMP9、TIMP1表達(dá)的原因之一。還有研究發(fā)現(xiàn)[16]，對于高血壓左室肥厚患者，離心性肥厚與向心性肥厚也是導(dǎo)致血清MMP9、TIMP1的表達(dá)及比值在不同研究中相悖的重要原因。

綜上所述，STS抑制壓力超負(fù)荷大鼠MF的作用機(jī)制至少與上調(diào)心肌局部HGF的表達(dá)有關(guān)。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色（×400）及Masson染色（×200）結(jié)果

圖2 各組大鼠心肌間質(zhì)和血管纖維化面積結(jié)果

圖3 各組大鼠心肌組織MMP9和TIMP1免疫組化半定量結(jié)果

圖4 各組大鼠心肌HGF的免疫組化染色結(jié)果

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Effect of TanshioneⅡA on expression of hepatocyte growth factor in pressure overloaded rats

CAI Hui，ZHANG Bei-bei，ZHANG Jing，et al.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Nanjing General Hospital of Nanjing Military command，Nanjing 210002，China

CAI Hui，E-mail：njzy_caihui@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of Sodium TanshinoneⅡA Sulfonate（STS）on expression of hepatocyte growth factor in pressure overloaded rats.MethodsPressure overloaded myocardial fibrosis models were established by abdominal aortic constriction.The SD rats were randomly divided into 5 groups:Sham group（n=8），Model group（n=7），Captopril group（n=7），STS-H group（n=7） and STS-L group（n=8）.8 weeks after operation，left ventricular mass indexes of rats in each group were measured，pathological changes of the myocardium were observed，the collagen volume fractions and hydroxyproline content were calculated， the expression levels of myocardial MMP9，TIMP1 and HGF were analyzed by immunohistochemistry.ResultsCompared with the Model group，the left ventricular mass indexes，myocardial hydroxyproline content and collagen volume fractions were markedly relieved，as well as expression levels of MMP9 and TIMP1 were significantly decreased（P<0.01，P<0.05），but the ratio of MMP9/TIMP1 were obviously increased（P<0.01，P<0.05）.The MOD values of HGF immumohistochemical staining in Captopril group（0.062±0.007），STS-H group（0.061±0.006）and STS-L group（0.038±0.005）compared with Model group（0.031±0.005）were obviously increased（P<0.01，P<0.05）.ConclusionSTS can improve myocardial fibrosis in pressure overloaded rats，which may be related with the up-regulation of HGF expression level at least.

TanshinoneⅡA；Pressure overload；Myocardial fibrosis；Hepatocyte growth factor

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院科研基金（項(xiàng)目編號：2014016）

作者單位：210002 江蘇省南京市，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科

蔡輝，E-mail：njzy_caihui@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.06.021

Q95-33；R542.2+3

A

1672-5301（2015）06-0567－04

2015-02-11）