王 琦，王一鳴，劉 鐵，郝 苗，叢憲玲，任光旭

（1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉133000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；3.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉133000）

免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）是一種通過抗原抗體特異性反應(yīng)來檢測并定位蛋白的方法，目前廣泛應(yīng)用于組織病理學(xué)診斷［1］?？乖迯?fù)是免疫組化實驗中的關(guān)鍵步驟，已有文獻針對現(xiàn)有的修復(fù)方式做了一個初步的比較，結(jié)果顯示微波高壓修復(fù)、微波熱修復(fù)以及高壓熱修復(fù)在相同的條件下具有相似的結(jié)果［2］。然而，抗原修復(fù)過程中選擇不同的緩沖液，可能對免疫組化結(jié)果產(chǎn)生不同的影響。在本文中，我們選擇高壓熱修復(fù)方式，研究兩種不同抗原修復(fù)液，即檸檬酸緩沖液及Tris－EDTA（TE）緩沖液，對免疫組化結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 組織

福爾馬林固定石蠟包埋的肺癌組織切片及結(jié)腸癌組織切片均來自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，切片厚度為3μm，每個蠟塊連續(xù)切取多張并貼附在商用硅包被的載玻片（世通公司）上，切片吸附后在65℃烤箱中烘烤2h以增強吸附力。

1.2 試劑

MUC1抗體分別購自BD公司（550486）和Abcam公司（ab10120），使用前按適當(dāng)比例稀釋。免疫組化檢測試劑盒及DAB染液均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 修復(fù)液

檸檬酸緩沖液（pH 6.0）、TE緩沖液（pH 7.6）。

1.4 免疫組化染色方法

將組織切片脫蠟入水，滴加3%H2O2孵育10 min，水洗，每例切片均經(jīng)上述兩種不同抗原修復(fù)液高壓處理2.5min（排氣后開始計時），之后沖涼水去壓，開蓋后自然冷卻至室溫。修復(fù)后按照試劑盒說明書進行操作，最終脫水后進行封片鏡檢。

2 結(jié)果

我們分別對肺癌和結(jié)腸癌兩類組織切片進行免疫組化染色實驗，每類組織均設(shè)有陰性對照、Abcam公司抗體組和BD公司抗體組，每組切片分別進行TE緩沖體系修復(fù)和檸檬酸緩沖體系修復(fù)。所有切片均由Olympus成像系統(tǒng)拍攝。

2.1 檸檬酸緩沖液vs TE緩沖液，肺癌

在肺癌組織切片中，結(jié)果如Fig 1所示，無論采用哪種緩沖體系，陰性對照均背景清晰；比較不同公司兩種抗體的染色結(jié)果，我們很容易看出BD公司的抗體染色更強一些。比較兩種不同的緩沖體系，我們發(fā)現(xiàn)TE緩沖液進行抗原修復(fù)的效果更強，染色更明顯。值得注意的是，Abcam公司的抗體配合檸檬酸緩沖體系的切片染色較淺，很容易被判定為陰性結(jié)果。以上結(jié)果表明TE緩沖液修復(fù)能力比檸檬酸緩沖液修復(fù)能力更強。

Fig.1 Immunohistochemistry for lung cancer.（Original magnification×100）

2.2 檸檬酸緩沖液vs TE緩沖液，結(jié)腸癌

如Fig 2所示，結(jié)腸癌的免疫組化結(jié)果與肺癌相似，但是兩種抗原修復(fù)液的對比并不十分明顯。所有的抗體染色均較清晰，但是在陰性組可見微弱染色，在可接受范圍之內(nèi)且與實驗組差別明顯。與TE緩沖液相比，檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)效果較好，染色較深，背景清晰，特異性顯著，更適合作為結(jié)腸癌組織切片的抗原修復(fù)液。

Fig.2 Immunohistochemistry for colon cancer.（Original magnification×100）

3 討論

免疫組化是臨床診斷和組織病理學(xué)中常用的檢測手段，抗原修復(fù)是免疫組化過程中不可忽略的關(guān)鍵步驟。主要原因在于免疫組化中常采用的固定液福爾馬林會影響抗原與抗體的識別。福爾馬林的主要成分是甲醛，可用于保存細胞形態(tài)，穩(wěn)定細胞基質(zhì)，防止細胞發(fā)生自噬或蛋白移位［3］。當(dāng)細胞內(nèi)被固定液浸潤后，主要的肽段和基本結(jié)構(gòu)都會保存下來。除此之外，一些核苷酸也可能會與福爾馬林發(fā)生反應(yīng)，而碳水化合物則不會有類似現(xiàn)象［4］。福爾馬林中的甲醛可以特定地結(jié)合到某些氨基酸殘基上，比如賴氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺［5］等。其中具體的原理還不清楚，可能是不帶電的氨基基團（－NH或NH2）與甲醛（CH2O）之間形成了亞甲基橋，方程式如下：

在這個反應(yīng)中，組織上的活性氫首先與甲醛發(fā)生反應(yīng)得到羥甲基，羥甲基再與其他的活性氫發(fā)生反應(yīng)最終得到交聯(lián)的蛋白［6］。因為這一過程消耗了氨基中的氫，所以擾亂了氨基酸之間原有的氫鍵和相互作用［7］，使蛋白質(zhì)的三級或四級結(jié)構(gòu)被破壞從而導(dǎo)致抗原不能很好的被抗體識別［8］。

因此，經(jīng)過固定的切片由于抗原與甲醛發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致蛋白信號被掩蓋。這種交聯(lián)在高溫加熱或是蛋白酶水解的作用下會發(fā)生可逆反應(yīng)，恢復(fù)蛋白的原有構(gòu)象，這一過程就是抗原修復(fù)［9］。自抗原修復(fù)技術(shù)發(fā)現(xiàn)以來，該過程已經(jīng)成為免疫組化中必經(jīng)的一步［10］。據(jù)文獻報道，在福爾馬林固定的組織中，大約有85%的抗原經(jīng)過優(yōu)化的抗原修復(fù)都會得到較好的免疫組化結(jié)果［11］。

目前研究者對于抗原修復(fù)的具體機理尚不清楚，且抗原修復(fù)方式不同，結(jié)果也各不相同。在本文中，我們比較了兩種不同的抗原修復(fù)液，發(fā)現(xiàn)TE緩沖液修復(fù)抗原的能力更強，但是同時也提升了暴露內(nèi)源性過氧化物酶以及脫片的風(fēng)險。

兩種抗原修復(fù)液最大的區(qū)別在于pH值不同和是否存在EDTA。pH對抗原修復(fù)影響很大，有些抗原可以在較大的pH范圍內(nèi)進行修復(fù)，而有些抗原只能在某一特定的pH值被修復(fù)［12］。此外，高pH緩沖液更容易使組織中內(nèi)源性生物素暴露。因此，在使用SP法進行實驗時，對酶系豐富的組織，如肝、腎等，應(yīng)優(yōu)先使用低pH緩沖液進行實驗，如檸檬酸緩沖液。EDTA是一種鈣或其他二價離子的螯合劑，鈣離子可以誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象發(fā)生改變最終引起免疫活性的改變［3，13］。由以上可以得出，檸檬酸修復(fù)液更適合表位容易暴露的抗原，TE緩沖液更適合信號較弱的抗原。因此，我們建議在抗原修復(fù)時，應(yīng)優(yōu)先使用檸檬酸鹽緩沖液，若是修復(fù)效果不理想，再用TE緩沖液進行嘗試。

此外，本文中我們使用了兩個不同公司針對同一抗原的抗體，但是實驗的結(jié)果并不一致，主要原因可能是它們針對的抗原表位不同。而且，在不同的組織中，結(jié)果也不十分相同，可能的原因是不同的組織中抗原發(fā)生交聯(lián)的程度不同。因此，在進行免疫組化實驗時，哪怕是同一種抗原，進行抗原修復(fù)的最優(yōu)方式也可能不同，在實驗前進行預(yù)實驗確定最佳實驗條件是必要的步驟。

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