王晶，余偉清，奚小土，劉云濤

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120

通腑活血法對(duì)膿毒癥肺損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究

王晶，余偉清，奚小土，劉云濤

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120

目的：探討通腑活血法對(duì)膿毒癥大鼠肺組織的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分成正常對(duì)照組（n=10）、模型組（n=15）、JAK2抑制劑（AG490）組（n=15）、Stars抑制劑（RPM）組（n=15）、桃核承氣湯高、中、低劑量組（n=15）。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）復(fù)制動(dòng)物模型，桃核承氣湯組于術(shù)前0.5 h和術(shù)后6 h按1.0 g/kg、2.0 g/kg、3.0 g/kg劑量灌胃，正常對(duì)照組、模型組、AG490組和RPM組相同時(shí)點(diǎn)灌胃等容積蒸餾水。大鼠造模術(shù)后24h處死動(dòng)物，并采集血清、肺組織標(biāo)本，PCR檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，光鏡觀察病理組織學(xué)改變。結(jié)果：各組大鼠進(jìn)行肺組織病理形態(tài)學(xué)評(píng)分，桃核承氣湯中劑量組及大劑量組大鼠肺組織的受損程度均明顯減輕，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組大鼠肺組織高遷移率族蛋白B1（HMGB1）含量明顯較正常對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。桃核承氣湯中劑量組與大劑量組HMGB1表達(dá)水平較模型組明顯減少（P＜0.05）。模型組大鼠肺組織HMGB1mRNA的表達(dá)明顯比正常對(duì)照組大鼠高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。桃核承氣湯中劑量組及大劑量組HMGB1mRNA的表達(dá)較模型組明顯減少（P＜0.05）。與模型組比較，RPM組、AG40組、桃核承氣湯中、大劑量組的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：桃核承氣湯可減輕膿毒癥大鼠肺組織的炎癥損傷，其機(jī)制可能與下調(diào)JAK/STAT信號(hào)通路活性，從而減少HMGB1mRNA表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的水平有關(guān)。

膿毒癥；肺損傷；JAK/STAT信號(hào)通路；通腑活血法；高遷移率族蛋白B1（HMGB1）

膿毒癥（sepsis）是由感染或有高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），具有十分復(fù)雜的病理生理過(guò)程，主要涉及免疫、微循環(huán)、凝血、腸道、肺臟等多個(gè)系統(tǒng)，急性肺損傷是其中最關(guān)鍵的病理生理改變。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種重要的“晚期”炎癥介質(zhì)，具有直接的毒性作用甚至致死效應(yīng)［1］。有研究報(bào)道，氣管內(nèi)給予HMGB1可引起小鼠嚴(yán)重肺損傷，腹腔注射大劑量HMGB1可致小鼠死亡，而HMGB1抗體對(duì)動(dòng)物具有明顯的保護(hù)效應(yīng)［2］。最近研究發(fā)現(xiàn)，JAK激酶（Janus Kinsey）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）即JAK/STAT可能作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體參與了HMGB1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，通過(guò)抑制JAK/STAT直接或間接下調(diào)HMGB1m RNA表達(dá)，抑制HMGB1的合成、釋放，從而減輕膿毒癥急性肺損傷［3～5］。本研究擬通過(guò)觀察具有通腑瀉下、活血化瘀的經(jīng)方桃核承氣湯對(duì)膿毒癥大鼠模型肺組織HMGB1、血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平等的影響，探討桃核承氣湯對(duì)膿毒癥大鼠過(guò)度炎癥反應(yīng)的抑制作用，同時(shí)通過(guò)與JAK/STAT特異性抑制劑治療組相對(duì)照，觀察2者HMGB1含量以及HMGB1m RNA的相對(duì)表達(dá)量，探討通腑活血法對(duì)膿毒癥大鼠肺組織的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 桃核承氣湯由桃仁、大黃、桂枝、芒硝、甘草按2∶2∶1∶1∶1組成，所有藥物由廣東省中醫(yī)院中心藥房提供。上述藥物適量水煎，頭煎20min，二煎30min，分別濾取藥液，合并兩次藥液，在60℃恒溫條件下濃縮成含生藥1 g/m L的藥液備用。

1.2 動(dòng)物分組及處理 體重200～220 g雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分成7組。正常對(duì)照組（n=10），模型組（n=15）［行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）］；JAK2抑制劑-AG490處理（AG490）組（n=15）［于術(shù)前0.5 h皮下注射8.0m g/kg的AG490，行CLP］；Stars抑制劑-雷帕霉素（RPM）處理（RPM）組（n=15）［于術(shù)前0.5 h皮下注射0.4m g/kg的AG490，行CLP］；桃核承氣湯高、中、低劑量組（n=15）［術(shù)前0.5 h和術(shù)后6 h按3.0 g/kg、2.0 g/kg、1.0 g/kg劑量灌胃，行CLP］。正常對(duì)照組、模型組、AG490組和RPM組術(shù)后6 h灌胃等容積蒸餾水。CLP復(fù)制動(dòng)物模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，可自由飲水。用10%水合氯醛0.3 m L/kg麻醉后，常規(guī)消毒皮膚，在腹中線偏下方行約2 cm切口，開(kāi)腹后小心分離盲腸，用3號(hào)線結(jié)扎回腸盲腸瓣，避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管。用18號(hào)針頭在盲腸穿刺3個(gè)孔，避開(kāi)血管，擠出少許糞便并還納腹腔，逐層關(guān)腹。術(shù)后立即腹腔注射生理鹽水20m L/kg抗休克，可自由飲水，禁食。術(shù)后24 h，分別將實(shí)驗(yàn)各組大鼠按造模先后順序頭部脫臼處死。迅速剪開(kāi)腹部縫線，探索分離下腔靜脈，取血約5m L備用（其中2m L置于含抗凝劑的硬質(zhì)塑料管中，其余的置于不含抗凝劑的硬質(zhì)塑料管中，分別作為炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子檢測(cè)之用）；分離各臟器組織，留取肺組織2份，1份置于含10%甲醛溶液的塑料瓶中，留作病理切片行病理形態(tài)學(xué)觀察；另一份置于-80℃低溫冰箱留作檢測(cè)m RNA表達(dá)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法 選擇固定位置留取肺臟器組織，分別用光鏡和電鏡肺臟的病理形態(tài)學(xué)改變。RT-PCR檢測(cè)肺組織HRIGB1m RNA表達(dá)（以β-Actin為內(nèi)參對(duì)照）；蛋白質(zhì)免疫印跡法（W estern blot）檢測(cè)大鼠肺組織HMGB1含量（與目標(biāo)蛋白β-Actin的蛋白條帶灰度做對(duì)比，以蛋白條帶灰度值判斷）；ELISA檢測(cè)血清炎癥因子水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS11.0軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料測(cè)定值以（±s）表示，組間比較比較采用方差分析。

2 研究結(jié)果

2.1 各組肺組織病理學(xué)改變比較 見(jiàn)表1、圖1。光鏡下正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整、肺泡間隔無(wú)水腫、炎癥，肺泡腔清晰；模型組肺泡大小不等，部分肺泡壁斷裂呈氣腫狀，部分肺泡萎縮，肺泡壁增寬，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺間質(zhì)見(jiàn)多行核細(xì)胞浸潤(rùn)；RPM組、AG490組、桃核承氣湯中劑量組、桃核承氣湯大劑量組與模型組比較，滲出明顯減少；桃核承氣湯小劑量組與模型組比較無(wú)明顯改變。進(jìn)一步對(duì)各組大鼠進(jìn)行肺組織病理形態(tài)學(xué)評(píng)分，桃核承氣湯中劑量組及大劑量組大鼠肺組織的受損程度均明顯減輕，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組肺組織病理形態(tài)學(xué)評(píng)分比較（±s） 分

表1 各組肺組織病理形態(tài)學(xué)評(píng)分比較（±s） 分

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組RPM組AG490組桃核承氣湯小劑量組桃核承氣湯中劑量組桃核承氣湯大劑量組n 10 15 15 15 15 15 15病理形態(tài)學(xué)評(píng)分0.24±0.34 3.14±0.45①2.16±0.34②2.09±0.23②3.12±0.48 2.34±0.26②2.45±0.41②

圖1 各組肺組織病理學(xué)光鏡圖

2.2 各組肺組織HMGB1表達(dá)比較 見(jiàn)表2。模型組大鼠肺組織HMGB1含量明顯較正常對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。桃核承氣湯中劑量組與大劑量組HMGB1表達(dá)水平較模型組明顯減少（P＜0.05）。

表2 各組肺組織HMGB1表達(dá)比較（±s）

表2 各組肺組織HMGB1表達(dá)比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組RPM組AG490組桃核承氣湯小劑量組桃核承氣湯中劑量組桃核承氣湯大劑量組n 10 15 15 15 15 15 15 HMGB1表達(dá)（相對(duì)灰度值）0.43±0.12 3.12±0.04①1.67±0.05②1.70±0.06②3.09±0.06 1.70±0.08②1.74±0.12②

2.3 各組肺組織HMGB1mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表3。模型組大鼠肺組織HMGB1m RNA的表達(dá)明顯比正常對(duì)照組大鼠高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。桃核承氣湯中劑量組及大劑量組HMGB1m RNA的表達(dá)較模型組明顯減少（P＜0.05）。

表3 各組肺組織HMGB1mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組肺組織HMGB1mRNA表達(dá)比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

n組別正常對(duì)照組模型組RPM組AG490組桃核承氣湯小劑量組桃核承氣湯中劑量組桃核承氣湯大劑量組10 15 15 15 15 15 15 HMGB1mRNA表達(dá)量（相對(duì)表達(dá)量）0.123±0.012 0.865±0.125①0.477±0.087②0.583±0.139②0.855±0.134 0.521±0.105②0.511±0.112②

2.4 各組炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4。與模型組比較，RPM組、AG40組、桃核承氣湯中、大劑量組的TNF-α、IL-6、IL-1β的水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子表達(dá)水平比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組RPM組AG490組桃核承氣湯小劑量組桃核承氣湯中劑量組桃核承氣湯大劑量組n 10 15 15 15 15 15 15 TNF-α（pg/mL）43.43±15.90 116.45±34.26①84.21±25.65②82.56±30.21②100.01±24.56 86.78±24.65②82.45±27.65②IL-6（pg/mL）32.67±9.47 127.48±25.32①83.31±23.45②79.47±25.78②96.23±30.21 90.26±27.21②87.33±25.54②*IL-1β（ng/mL）1.24±0.12 9.34±1.72①7.21±0.99②7.34±1.01②8.21±0.78 7.98±1.21②7.69±1.43②

3 討論

在膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致的多器官功能障礙綜合征（MODS）中，肺組織往往是最先受累的器官，由此誘發(fā)的急性肺損傷（ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是臨床上膿毒癥患者致死的主要原因之一［7～11］。盡管當(dāng)前器官功能支持取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但仍缺乏有效的具有肺功能保護(hù)作用的藥物。

Kim JH等［12］采用盲腸結(jié)扎穿孔致嚴(yán)重腹腔感染模型結(jié)果顯示，膿毒癥時(shí)高度活化，且肝、肺、腸組織中STAT1、STAT3分別與相應(yīng)器官HMGB 1m RNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)，初步提出兩者之間可能存在一定的相關(guān)性。國(guó)內(nèi)研究者發(fā)現(xiàn)，抑制 JAK/STAT信號(hào)通路活化可以明顯下調(diào)肝組織HMGB1m RNA表達(dá)，并有助減輕CLP所致急性肝損傷［13～15］。本研究基于膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中JAK/STAT信號(hào)通路的重要作用及對(duì)炎癥標(biāo)志物HMGB1的認(rèn)識(shí)，探討了通腑活血代表方（桃核承氣湯）對(duì)膿毒癥大鼠肺組織的保護(hù)作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其能減輕大鼠肺組織損傷；進(jìn)一步研究結(jié)果表明，桃核承氣湯對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路有一定的調(diào)控作用，提示其可能通過(guò)作用于JAK/STAT信號(hào)通路，減少HMGB1m RNA的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平。然而，通腑活血法代表方劑桃核承氣湯影響JAK/STAT通路活性的機(jī)制如何？除JAK/STAT信號(hào)通路外，其他信號(hào)通路在其中發(fā)揮著怎樣的作用？這些問(wèn)題仍有待在今后的研究中進(jìn)一步探討。

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Preventive Mechanism of Therapy of Unblocking Bow els and Activating Blood for Lung Injury of Sepsis Pyohemia Rats

WANG Jing，YU Weiqing，XIXiaotu，LIU Yuntao

Objective：To explore the preventive mechanism of Chinese medicine （CM） with the action of unblocking bowelsand activating blood for lung tissue of sepsis pyohemia rats. Methods：One hundred male Sprague Dawley （SD） rats wererandomly divided into 7 groups，namely normal group，model group，JAK2 inhibitor （AG490） group，STAT inhibitor （RPM）group，and low- ，medium- ，and high- dose Taohe Chengqi Tang （TCT）groups. Animal models were established by cecalligation and puncture （CLP）. The low- ，medium- ，and high- dose TCT groups were given gastric gavage of TCT in the dose of1.0g/kg，2.0g/kg，3.0g/kg respectively half hour before CLP and 6 hours after CLP. Other groups were given gastric gavage ofthe same volume of distilled water at the same time. Twenty- four hours after modeling，the rats were sacrificed for obtainingserum and lung tissue. The associated indexes were measured by polymerase chain reaction （PCR），and pathologic changes inlung tissue were observed under microscope. Results：The severity of lung tissue damage was reduced in the medium- andhigh- dose TCT groups （P＜0.05 compared with that in the model group）. The content and the mRNA expression level of highmobility group box- 1 protein （HMGB1） in the model group were higher than that in the normal group（P＜0.05），and medium andhigh dose of TCT had an effect on reducing the content and mRNA expression level of HMGB1（P＜0.05 compared with those inthe model group）. The contents of tumor necrosis factor- α（TNF- α），interleukin- 1β（IL- 1β），interleukin- 6 （IL- 6） in RPM group，AG40 group and medium- and high- dose TCT groups were decreased （P＜0.05 compared with those in the model group）.Conclusion： TCT can relieve the inflammation of lung issue，and the mechanism may be related to decreasing the levels ofinflammation factors of TNF- α，IL- 6 and IL- 1β through down- regulating the activities of JAK/STAT pathway to decreaseexpression of HMGB1.

Sepsis pyohemia；Lung injury；JAK/STAT signal pathway；Therapy of Unblocking bow els and activating blood；Highmobility group box-1 protein（HMGB1）

R631

A

0256-7415（2015）08-0266-04

10.13457/j.cnki.jncm.2015.08.122

2015-01-01

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（20130319c）

王晶（1970-），女，副主任醫(yī)師，主要從事急危重癥的臨床與基礎(chǔ)研究。

劉云濤，E-mail：iam liuyuntao@163.com。