曾才秀，詹霞，袁海斌，李青，謝圭，謝綱，楊作成

腫瘤壞死因子-β基因G252A多態(tài)性與川崎病的關(guān)聯(lián)性研究*

曾才秀1，詹霞2，袁海斌1，李青1，謝圭2，謝綱1，楊作成2

（1.湖南省湘潭市婦幼保健院兒科，湖南湘潭411100；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科，湖南長沙410013）

目的探討腫瘤壞死因子-β（TNF-β）基因G252A多態(tài)性與川崎病發(fā)病及川崎病冠狀動脈損傷的關(guān)聯(lián)性。方法應(yīng)用基因測序方法，對100例川崎病患兒與92例健康兒童TNF-β基因G252A位點多態(tài)性進(jìn)行檢測。結(jié)果川崎病組TNF-β基因G252A位點AG、AA、GG基因型分布與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.86，P＞0.05），川崎病組A、G等位基因頻率與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.53，P＜0.05），川崎病合并冠狀動脈損傷組（CAL）與無冠狀動脈損傷組（NCAL）基因型和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.37和0.59，P＞0.05）。結(jié)論尚未發(fā)現(xiàn)TNF-β基因G252A位點基因型分布與川崎病的發(fā)病及冠狀動脈損傷存在關(guān)聯(lián)性，但川崎病患者G等位基因頻率較健康對照組高。

腫瘤壞死因子-β；川崎??；基因多態(tài)性

川崎病是以全身性血管炎癥為主要病理改變的一種發(fā)熱出疹性疾病，冠狀動脈病變是其嚴(yán)重并發(fā)癥。盡管大劑量丙種球蛋白的運用使得川崎病冠狀動脈并發(fā)癥的發(fā)病率明顯降低，但仍有2%～3%患兒最終可能發(fā)生冠狀動脈狹窄、閉塞，預(yù)后不良。該病的病因及致病機(jī)制至今未完全闡明，遺傳因素可能在其發(fā)病中起一定作用。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是體內(nèi)具有多種生物活性的重要致炎細(xì)胞因子，目前已知的TNF分為TNF-α和TNF-β兩種，分別由TNF-α基因和TNF-β基因編碼。研究發(fā)現(xiàn)，TNF與川崎病的發(fā)病存在相關(guān)［1］，但其多態(tài)性與川崎病的關(guān)系仍在研究中。本文應(yīng)用基因測序方法檢測TNF-β基因G252A位點多態(tài)性，觀察川崎病患兒TNF-β基因G252A多態(tài)性與川崎病發(fā)病及川崎病冠狀動脈損傷的相關(guān)性，以探討其與川崎病發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1研究對象

1.1.1川崎病組選取2010年-2015年在湖南省湘潭市婦幼保健院及湘雅三醫(yī)院兒科就診的100例川崎病患兒，均符合《諸福棠實用兒科學(xué)》川崎病診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。所有患兒均為漢族，年齡4個月～7歲，其中男64例，女36例，平均年齡（2.49±1.49）歲。所有患兒均調(diào)查其年齡、性別，同時檢測血常規(guī)、血清免疫球蛋白、補體C3、肝功能、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、血紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR），并進(jìn)行動態(tài)心臟彩超多普勒檢查（見表1）。其中川崎病合并冠狀動脈損傷（coronary artery lesion，CAL）的診斷指標(biāo)參考日本川崎病研究委員會標(biāo)準(zhǔn)：＜2歲，冠狀動脈主干內(nèi)徑≥2.5 mm；＜5歲，冠狀動脈主干內(nèi)徑≥3.0 mm；≥5歲，冠狀動脈主干內(nèi)徑≥4.0 mm；某段管徑為鄰近段的1.5倍及以上；冠狀動脈內(nèi)徑與主動脈根部內(nèi)徑之比＞0.3；管壁明顯不規(guī)則。

表1100　例川崎病患兒臨床資料（入院5 d內(nèi)所收集的資料）

1.1.2健康對照組2010年-2015年在本院體檢的92例中國漢族兒童，排除感染性疾病、心血管疾病、風(fēng)濕性疾病以及既往川崎病病史等，年齡9個月～9歲，其中男57例，女35例，平均年齡（2.62± 2.02）歲。

1.2研究方法

1.2.1.基因組DNA的提取應(yīng)用Pure Gene DNA提取試劑盒，提取各組外周血基因DNA，置于-20℃冰箱冷凍儲藏備用［3］。

1.2.2.TNF-β基因G252A位點多態(tài)性的基因檢測應(yīng)用PCR-RFLP檢測TNF-β基因G252A位點多態(tài)性，引物設(shè)計：正向為5'-CCTCAGCCTTTCCT GCCTTTG-3'，反向為5'-CGTGGTGGGATGTGGAGG AGGA-3'（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）。PCR反應(yīng)體系為25μl體系，包括模板DNA 2μl（約200 ng），正反向引物各0.5μl（1μmol/l），2×Master Mix 12.5μl，去離子水加至25μl。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（美國基因公司，PCR system 9700）上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃（5 min）后，95℃（30 s）→61℃（60 s）→72℃（60 s）（35個循環(huán)），終末延伸72℃（10 min）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司以雙脫氧鏈終止法（Sanger法）進(jìn)行基因測序。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用直接計數(shù)法計算出川崎病組和健康對照組TNF-β基因G252A位點各種基因型頻率和等位基因頻率，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，表明各基因型頻率已達(dá)遺傳平衡，具有群體代表性。各組間構(gòu)成比用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TNF-β基因PCR產(chǎn)物圖

TNF-β基因G252A位點PCR擴(kuò)增片段為669 bp，見圖1。

2.2TNF-β基因G252A位點測序圖

將TNF-β基因G252A位點PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Sanger法進(jìn)行基因測序，其不同基因型的測序圖見圖2。

2.3TNF-β基因G252A位點的基因型分布及等位基因頻率

由表2可見，川崎病組TNF-β基因G252A位點AG、AA、GG基因型分布與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.86，P＞0.05），川崎病組TNF-β基因G252A位點A、G等位基因頻率與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.53，P＜0.05），川崎病組的合并冠狀動脈損傷（CAL）組與無冠狀動脈損傷（NCAL）組基因型和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.37和0.59，P＞0.05）。

圖1　TNF-β基因PCR產(chǎn)物圖

圖2　TNF-β基因G252A位點測序圖

表2　TNF-β基因G252A位點川崎病組和正常對照組基因型分布及等位基因頻率比較例（%）

3 討論

TNF-β是腫瘤壞死因子超家族中的重要成員之一，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等。TNF-β可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，參與激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)炎癥反應(yīng)；參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，從而在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中起著重要作用［4］。TNF-β由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，故又名淋巴毒素。TNF-β位于主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅲ類基因區(qū)HLA-DR以及HLA-B位點之間的HLA-Ⅲ抗原基因簇，即6p21區(qū)域，與MHC基因緊密連鎖。TNF-β全長約為3 kb，包括4個外顯子和3個內(nèi)含子，并含34個氨基酸殘基組成的信號肽，由205個氨基酸殘基組成。其252位點位于第1內(nèi)含子內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄起始位點下游存在鳥嘌呤（G）→腺嘌呤（A）的單核苷酸多態(tài)性變化（+252G/A）［4-5］，該多態(tài)性的改變使其與受體結(jié)合能力提高，從而提高了TNF-β的轉(zhuǎn)錄活性。

川崎病在亞急性期和恢復(fù)期，可因冠狀動脈擴(kuò)張、狹窄、閉塞和動脈瘤而發(fā)生心肌缺血、甚至心肌梗死，已經(jīng)成為兒童獲得性心臟病的常見原因之一。川崎病的發(fā)病及其并發(fā)的冠狀動脈損傷等均與遺傳易感性存在關(guān)聯(lián)，既往研究也發(fā)現(xiàn)多個基因的多態(tài)性變化與其發(fā)病相關(guān)［3，6］。AHN等［7］發(fā)現(xiàn)川崎病患兒血漿TNF-α明顯增高，說明川崎病存在免疫調(diào)節(jié)改變。但對TNF-α啟動子區(qū)域-238及-308位點的多態(tài)性進(jìn)行檢查，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性與川崎病的發(fā)生及冠狀動脈損傷存在關(guān)聯(lián)。文獻(xiàn)報道TNF-β基因252位點多態(tài)性與淋巴瘤［8］、偏頭痛的畏光［9］、慢性乙型肝炎和丙型肝炎等［10］有關(guān)。在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-β基因252位點與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血清三酰甘油、低密度脂蛋白水平存在相關(guān)性［4］。CRUZOLIVO等［11］首次對墨西哥48例川崎病患兒淋巴毒素基因+252位點基因多態(tài)性進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，其基因型和等位基因頻率和川崎病及川崎病冠狀動脈損傷間均未見明顯關(guān)聯(lián)性。本研究顯示，川崎病組TNF-β基因G252A位點AG、AA、GG基因型分布與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而川崎病組TNF-β基因G252A位點G等位基因頻率明顯高于健康對照組，而A等位基因頻率明顯低于健康對照組（χ2=4.53，P＜0.05），說明其A、G等位基因頻率與川崎病的發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)性。TNF-β基因G252A位點的多態(tài)性可能在川崎病的發(fā)病機(jī)制中起到一定作用，或可能是川崎病因中的一個風(fēng)險因子，但川崎病合并CAL組與NCAL組基因型和等位基因頻率與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明兩者間無明顯關(guān)聯(lián)性，或與樣本量仍然偏小有一定關(guān)系。由于TNF-β基因多態(tài)性與川崎病發(fā)病的關(guān)聯(lián)性研究尚少，因此，有關(guān)TNF-β基因G252A位點多態(tài)性與川崎病及其冠狀動脈損傷的關(guān)系及其與川崎病發(fā)病及預(yù)后的確切關(guān)聯(lián)性有待進(jìn)一步深入研究。基因多態(tài)性直接關(guān)系到人類對疾病的易感性、對環(huán)境因子及治療反應(yīng)的差異性以及疾病臨床表型的多樣性，而TNF-β基因G252A位點多態(tài)性與川崎病關(guān)系的進(jìn)一步研究可能把炎癥和遺傳兩種機(jī)制在一定程度上聯(lián)系起來，以更好地為臨床工作提供參考。

［1］李志萍，竇山朵.46例川崎病患者腫瘤壞死因子水平及意義［J］.中華實用診斷與治療雜志，2013，27（11）：1137-1138.

［2］胡亞美，江載芳，主編.諸福堂實用兒科學(xué)［M］.第8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：698-704.

［3］陳芳，江杰，李卓穎，等.谷胱甘肽過氧化物酶1基因多態(tài)性與川崎病的關(guān)聯(lián)性分析［J］.中國動脈硬化雜志，2015，23（3）：290-294.

［4］GARG PR，SARASWATHY KN，KALLA AK，et al.Pro-inflammatory cytokine gene polymorphisms and threat for coronary heart disease in a North Indian Agrawal population［J］.Gene，2013，514（1）：69-74.

［5］韋艷丹，曾華松.廣州地區(qū)漢族兒童白細(xì)胞介素-6基因174位點及腫瘤壞死因子β基因Nco I位點多態(tài)性分析［J］.中國當(dāng)代兒科雜志，2014，16（8）：846-850.

［6］李卓穎，韓冬，江杰，等.川崎病患兒血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1基因373位點及1688位點基因多態(tài)性研究［J］.中國循環(huán)雜志，2013，28（4）：285-288.

［7］AHN SY，JANG GC，SHIN JS，et al.Tumor necrosis factor-alpha levels and promoter polymorphism in patients with Kawasaki disease in Korea［J］.Yonsei Med J，2003，44（6）：1021-1026.

［8］CHENG S，LI J，LIU W，et al.LTA+252A＞G polymorphism is associated with risk of nasal NK/T-cell lymphoma in a Chinese population：a case-control study［J］.BMC Cancer，2015，15：480.

［9］ISHII M，USAMI S，HARA H，et al.MAOA and TNF-β gene polymorphisms are associated with photophobia but not osmophobia in patients with migraine［J］.Acta Neurol Taiwan，2014，23（2）：40-48.

［10］JENG JE，WU HF，TSAI MF，et al.Independent and additive interaction between tumor necrosis factor β+252 polymorphisms and chronic hepatitis B and C virus infection on risk and prognosis of hepatocellular carcinoma：a case-control study［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（23）：10209-10215.

［11］CRUZ-OLIVO F，GARCíA-ELORRIAGA G，GONZáLEZ-BONI LLA C，et al.Tumor necrosis factor-308 and lymphotoxin+252 polymorphisms in Mexican children with Kawasaki disease and coronary aneurysms［J］.Arch Med Res，2011，42（7）：602-607.

（張蕾編輯）

Association of locus G252A polymorphisms of tumor necrosis factor-β gene with Kawasaki disease*

Cai-Xiu ZENG1，Xia ZHAN2，Hai-Bin YUAN1，Qing LI1，Gui XIE2，Gang XIE1，Zuo-Cheng YANG2
（1.Department of Pediatrics，Maternal and Child Health Hospital of Xiangtan City，Xiangtan，Hunan 411100，P.R.China；2.Department of Pediatrics，the Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410013，P.R.China）

【Objective】To investigate the association of the locus G252A polymorphisms of tumor necrosis factor-β（TNF-β）gene with Kawasaki disease（KD）.【Methods】The Sanger gene sequencing method was employed to detect the locus G252A polymorphisms ofTNF-βgene in 100 patients with KD and 92 healthy controls.【Results】For locus G252A polymorphism inTNF-βgene，there was no significant difference between the KD patients and healthy controls in genotyping frequencies of AG，AA or GG（χ2=4.86，P＞0.05）. However，there was a significant difference in the allele frequencies of A and G between the KD patients and healthy controls（χ2=4.53，P＜0.05）.And there were no significant differences in genotype frequencies or in allele frequencies（χ2=3.37 and 0.59，P＞0.05）between the KD patients complicated with coronary artery injury group（CAL）and that without coronary artery lesion group（NCAL）.【Conclusions】There is no correlation between genotype of the locus G252A ofTNF-βgene and either the risk of KD or coronary artery injury of KD patients.But the G allele frequency in KD patients is higher than that in healthy controls.

tumor necrosis factor-β；Kawasaki disease；polymorphism

R725.4

A

1005-8982（2015）36-0035-04

2015-09-09

湘潭市科技局科研基金資助項目（No：SF20142002）