李嬋娟　王婧　楊潔

摘要：采用干酪素平板透明圈法從垃圾附近的土壤中分離得到1株產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)良菌株，通過測定其16S rDNA基因序列，鑒定該菌為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。以酪蛋白為底物對該菌所產(chǎn)蛋白酶粗酶液進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，結(jié)果表明，該酶最適反應(yīng)pH為8.5，為堿性蛋白酶；在pH 6.0～9.0的緩沖液中于4 ℃放置12 h后仍有90%以上的酶活性，說明該酶在中性和堿性條件下非常穩(wěn)定。該酶最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在70 ℃和80 ℃處理30 min后仍分別保有68%和45%的殘余酶活性，從而表明該酶具有較好的熱穩(wěn)定性。Mg2+和Fe2+對該酶活性幾乎沒有影響，K+和Mn2+對該酶活性有輕微的抑制作用，EDTA對該酶活性有明顯的抑制作用；Cu2+對該酶活性也有26%的抑制作用，只有Ca2+對該酶活性有10%左右的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：蛋白酶產(chǎn)生菌；分離；鑒定；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號：Q814.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4794-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.035

Abstract：A bacterium producing high protease was isolated from soil around the dump by method of casein plate. The strain was identified as Pseudomonas aeruginosa by measuring its 16S rDNA sequence. The characteristics of the crude protease produced by this strain were studied by using casein as the substrate. The results showed that the crude protease displayed the maximum activity at pH 8.5， therefore， this enzyme was an alkalic protease. The crude enzyme still had 90% of the highest activity after overnight incubation at 4 ℃， pH 6.0～9.0， indicating that the enzyme was very stable under neutral or alkaline conditions. The optimum temperature of the enzyme was 55 ℃. After incubation at 70 ℃ and 80 ℃ for 30 min， it remained 68% and 45% of the highest activity， respectively，so the protease was considered to have a superior thermal stability. The activity of the protease may be dependent on divalent metal ions， because it was not affected by Mg2+ or Fe2+ and was slightly inhibited by K+ and Mn2+， but was obviously inhibited by EDTA， strongly inhibited by Cu2+， reducing by 26% of its activity， and only Ca2+ could increased the activity by 10%.

Key words： protease-producing bacteria； isolation； identification； enzymatic property

蛋白酶是催化水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱，它作用于蛋白質(zhì)，將其分解為游離氨基酸或多肽。蛋白酶是一種重要的工業(yè)化應(yīng)用酶制劑，廣泛應(yīng)用于洗滌、制革、醫(yī)藥、食品加工、飼料、化學(xué)工業(yè)、廢物處理等行業(yè)[1]。蛋白酶普遍存在于動植物及微生物中，其中微生物所產(chǎn)的蛋白酶都是胞外酶，而且微生物具有生長速度快、生長條件較簡單、下游技術(shù)處理相對簡單并適用于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此微生物成為了生物酶的重要來源[2]。但是，利用微生物生產(chǎn)蛋白酶技術(shù)還存在產(chǎn)物活性不高、性質(zhì)差異性大、基因工程菌不穩(wěn)定等問題，因此篩選高產(chǎn)蛋白酶生產(chǎn)菌株仍是解決諸多問題的重要手段[3]。另外，新型蛋白酶的研究對新產(chǎn)品開發(fā)和拓寬應(yīng)用領(lǐng)域以及深化對多樣性、序列和分子進(jìn)化等領(lǐng)域的認(rèn)識均有重要意義[4]。因此，本試驗(yàn)對高產(chǎn)蛋白酶的菌株進(jìn)行了篩選和鑒定工作，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，期望獲得具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的蛋白酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 取校園垃圾堆、污水溝附近的土壤，從中分離產(chǎn)蛋白酶的菌株。

1.1.2 主要試劑及儀器 酪蛋白（AR）、酪氨酸（AR）、福林酚（GR）、PCR相關(guān)試劑（GR）、PCR儀（Bio-rad Thermal Cycler MyCycler）、高速離心機(jī)（5424型，Eppendorf）、722可見分光光度計(jì)、振蕩培養(yǎng)箱（SPX-250B-D型）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082BS型）等。

1.1.3 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基：牛肉膏1.0%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂1.6%，干酪素1.0%，pH 7.0。復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，干酪素0.8%，酵母膏0.1%，葡萄糖0.1%，NaCl 0.58%，檸檬酸三鈉0.45%，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌株的初篩 稱取所采集的土樣10 g加至裝有90 mL無菌去離子水的250 mL三角瓶中，振蕩30 min后靜置2 min，取上清液1 mL加入到裝有9 mL無菌去離子水的試管中，充分混勻，即成10-1的稀釋菌液，再吸取1 mL 10-1的稀釋菌液移入9 mL無菌水的試管中并搖勻，得到的菌懸液濃度稀釋為10-2，依次進(jìn)行，得到稀釋梯度為10-3、10-4、10-5、10-6的菌懸液。分別吸取100 μL的10-4、10-5、10-6梯度的菌懸液至篩選培養(yǎng)基平皿中，涂布均勻后，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑選產(chǎn)生透明圈的單菌落。

1.2.2 產(chǎn)酶菌株的復(fù)篩與酶活性測定 挑選初篩產(chǎn)透明圈的菌株接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37 ℃的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)16 h后測定發(fā)酵液的酶活。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。精確稱取酪氨酸50 mg，加少量0.2 mol/L HCl溶解，用去離子水定容至100 mL（500 μg/mL），再將此標(biāo)準(zhǔn)液稀釋到濃度為0～100 μg/mL，取不同濃度的稀釋液1 mL加0.5%酪蛋白溶液2 mL，放入37℃水浴中保溫20 min，再加入10%三氯乙酸3 mL ，混勻，在6 000 r/min下離心8 min。取上清液1 mL，加0.55 mol/L Na2CO3溶液5 mL 和福林酚試劑1 mL，放入37 ℃水浴中顯色15 min。用不含酪氨酸溶液的試劑作為對照，在680 nm波長下測定吸光度。以酪氨酸的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）酶活力的測定。各取1 mL粗酶液置于兩支離心管中，其中一支放入沸水中煮沸5 min使酶液滅活作為對照管，另一支為測定管。在對照管和測定管中分別加入2 mL 0.5%酪蛋白溶液，然后置于55 ℃水浴中反應(yīng)20 min，取出后向兩支離心管中均加入10%的三氯乙酸3 mL，混勻，離心。在兩支離心管中各取上清液1 mL，加0.55 mol/L Na2CO3溶液5 mL和福林酚試劑1 mL。放入37 ℃水浴中顯色15 min。用對照管調(diào)零，根據(jù)吸光度計(jì)算酶活。單位酶活定義：1 mL酶液在特定條件下每分鐘水解酪蛋白溶液生成1 μg酪氨酸所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

1.2.3 產(chǎn)酶菌株的初步鑒定 對復(fù)篩所得的菌株測定其16S rDNA基因序列以進(jìn)行菌株鑒定。使用細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）提取基因組DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物序列為：P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；P2： 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系包括10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL；dNTP （10 mmol/L）1 μL；引物P1、P2（10 μmol/L）各1 μL；模板DNA 1 μL；Taq DNA Polymerase （5 U/μL） 1 μL；最后補(bǔ)充去離子水至50 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 5 min； 94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收后送至華大基因公司進(jìn)行測序。將所測細(xì)菌16S rDNA基因序列同GenBank數(shù)據(jù)庫的基因序列進(jìn)行比對分析，以確定該菌類型。

1.2.4 產(chǎn)酶菌株酶學(xué)性質(zhì)的研究 ①pH對酶活性的影響。配制pH 3.0～10.0梯度緩沖溶液（pH 3.0～8.0為Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 8.5～10.0為NaOH-Gly緩沖液），以不同pH緩沖液配制0.5%酪蛋白底物，按照上述酶活性測定方法，測定酶液在不同pH條件下的酶活。②酶的pH穩(wěn)定性。各取1 mL酶液于pH 3.0～10.0的緩沖液中4 ℃放置12 h，以最適pH緩沖液配制0.5%酪蛋白底物測定活性，以未用緩沖液處理酶液的酶活為100%，計(jì)算相對酶活性。③溫度對酶活性的影響。以最適pH緩沖液配制濃度為0.5%酪蛋白底物，按照酶活性測定方法測定酶液在不同溫度下的酶活，以確定酶液的最適反應(yīng)溫度。④酶的熱穩(wěn)定性。各取1 mL酶液分別放入30、40、50、60、70、80 ℃的水浴鍋中保溫30 min，然后在最適pH和最適溫度下測定酶活性，以未處理酶液的酶活為100%，計(jì)算相對酶活。⑤金屬離子對酶活性的影響。按照酶活的測定方法，測定終濃度為1 mmol/L的Fe2+、Mg2+、K+、Mn2+、Cu2+、Ca2+和EDTA對酶活性的影響，對照反應(yīng)體系中不加任何化合物，以對照酶活為100%，計(jì)算相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的初篩結(jié)果

通過酪蛋白篩選培養(yǎng)基初篩后獲得6株產(chǎn)透明圈菌株，測定6株菌的菌落直徑和透明圈直徑，并計(jì)算透明圈直徑和菌落直徑的比值，結(jié)果如表1所示。由表1可知，5號菌和6號菌的透明圈直徑與菌落直徑的比值較大。有文獻(xiàn)[3，5]報(bào)道，透明圈直徑大小以及透明圈與菌落直徑的比值與蛋白酶活力高低并非呈顯著的正相關(guān)。因此，對6株菌株均進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，分別測定其發(fā)酵液酶活。

2.2 產(chǎn)酶菌株的復(fù)篩結(jié)果

在酪氨酸濃度為0～100 μg/mL范圍內(nèi)，測定其680 nm吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.001 6x+0.004 4，R2=0.996 0。根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算6株菌株發(fā)酵液粗酶的活性如圖1所示，過夜培養(yǎng)后5號菌的酶活最高，達(dá)到11.5 U/mL，因此選擇5號菌株進(jìn)行分子鑒定和酶學(xué)性質(zhì)測定。

2.3 產(chǎn)酶菌株的初步鑒定結(jié)果

將5號菌株的16S rDNA測序結(jié)果通過Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對后，結(jié)果表明該序列與假單胞菌屬銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株同源性最高，達(dá)到99%。細(xì)菌分類學(xué)家認(rèn)為，當(dāng)16S rDNA的同源性高于97%時(shí)，可以認(rèn)為是屬內(nèi)同種，低于95%則認(rèn)為是屬外成員[3]。根據(jù)同源性比對結(jié)果，初步確定該菌為銅綠假單胞菌。

2.4 產(chǎn)酶菌株的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 pH對酶活性的影響 pH對酶活性有重要的影響，反應(yīng)體系中的pH會影響酶和底物基團(tuán)的解離狀態(tài)和電荷性質(zhì)，從而影響酶與底物復(fù)合物的形成，最終影響酶活力，極端pH條件下甚至?xí)姑傅鞍鬃冃?。由圖2可知，當(dāng)pH<5.0時(shí)，酶活非常低；該酶在pH 5.5～10.0時(shí)活性均較高，且在pH 8.5時(shí)酶活達(dá)到最大，說明該蛋白酶為堿性蛋白酶。堿性蛋白酶廣泛應(yīng)用于洗滌、制革和食品加工行業(yè)，因此該酶在這些領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。目前工業(yè)應(yīng)用的堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株多為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）[6]，但國外有學(xué)者嘗試?yán)弥聘锕I(yè)中含蛋白質(zhì)的廢棄物發(fā)酵銅綠假單胞菌生產(chǎn)蛋白酶[7]。

2.4.2 酶的pH穩(wěn)定性 酶液在不同pH緩沖液中于4 ℃保存12 h后，測得的相對酶活如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)緩沖液pH<4.0時(shí)，相對酶活低于50%；在pH 4.0～10.0的緩沖液中，相對酶活均在60%以上，尤其是在pH 6.0～9.0的緩沖液中相對酶活達(dá)到90%以上，說明該酶的pH穩(wěn)定性較好，尤其是在中性和堿性條件下該酶非常穩(wěn)定，這更有利于該酶的工業(yè)應(yīng)用。

2.4.3 溫度對酶活性的影響 反應(yīng)溫度對酶活性也有較大的影響，一方面溫度升高能加快反應(yīng)速度，另一方面高溫也會導(dǎo)致酶蛋白變性失活。由圖4可知，當(dāng)溫度低于55 ℃時(shí)，隨著溫度的增加酶活性逐步增加，當(dāng)反應(yīng)溫度超過55 ℃時(shí)，活性急劇降低，可知該蛋白酶最適反應(yīng)溫度為55 ℃。這與Zambare等[8]發(fā)現(xiàn)Pseudomonas aeruginosa MCM B-327所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)有所不同，其最適溫度僅為35 ℃。在30 ℃和60 ℃時(shí)該酶活性也能達(dá)到最高酶活的60%以上，說明該酶的作用溫度范圍較廣。

2.4.4 酶的熱穩(wěn)定性 將該酶置于不同的溫度下保溫30 min后測得的相對酶活如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)處理溫度低于60 ℃時(shí)，相對酶活均在90%以上，而且在70 ℃和80 ℃處理30 min后仍分別有68%和45%的殘余酶活，說明該酶有非常好的熱穩(wěn)定性。

2.4.5 各種金屬離子對酶活性的影響 由圖6可知，Mg2+和Fe2+對該酶活性幾乎沒有影響，K+和Mn2+對該酶有輕微抑制作用，而重金屬離子Cu2+對該酶有較強(qiáng)的抑制作用，使其活性降低了26%，說明該酶可能對重金屬離子敏感。但有文獻(xiàn)[9]報(bào)道，某些銅綠假單胞菌可以產(chǎn)重金屬離子耐受型蛋白酶。另外EDTA對該酶也有較明顯的抑制作用，說明該酶可能為二價(jià)金屬離子依賴型酶。在所驗(yàn)證的金屬離子中只有Ca2+對該酶活性有10%左右的促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

從土壤中篩選到一株產(chǎn)蛋白酶菌株，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為銅綠假單胞菌屬。假單胞菌是蛋白酶的一個(gè)重要來源，目前已有多種產(chǎn)蛋白酶假單胞菌屬菌株被報(bào)道[9]，有的甚至產(chǎn)低溫蛋白酶[10]。本試驗(yàn)中分離得到的銅綠假單胞菌所產(chǎn)蛋白酶與已報(bào)道的銅綠假單胞菌蛋白酶的最適pH、最適溫度以及重金屬離子的耐受性有明顯不同[8]。該蛋白酶最適pH為8.5，在pH 6.0～9.0的緩沖液中于4 ℃放置12 h后仍保有90%以上的酶活，說明該酶在中性和堿性條件下非常穩(wěn)定。該酶最適反應(yīng)溫度為55 ℃，同時(shí)該酶還具有較好的熱穩(wěn)定性，在70 ℃和80 ℃處理30 min后仍分別保持有68%和45%的相對酶活。Mg2+和Fe2+對該酶活性幾乎沒有影響，K+和Mn2+對該酶活性有輕微抑制作用，Cu2+對該酶活性有26%的抑制作用，EDTA也有較明顯的抑制作用，只有Ca2+對該酶活性有10%左右的促進(jìn)作用。

該菌所產(chǎn)蛋白酶為pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好的堿性蛋白酶，在洗滌工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在下一步研究中，計(jì)劃克隆該菌蛋白酶基因，構(gòu)建基因工程菌，并利用基因工程或蛋白質(zhì)工程的手段進(jìn)一步提高該酶活性以及pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，使其更加適合在工業(yè)上應(yīng)用。

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