趙永剛，鄒艷麗，張永強，吳曉東，王清華，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島　266032）

蘇丹型埃博拉病毒焦磷酸測序方法的建立

趙永剛，鄒艷麗，張永強，吳曉東，王清華，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島266032）

［目的］ 本研究旨在通過對埃博拉病毒進行序列信息分析的基礎上，利用焦磷酸測序技術對蘇丹型埃博拉病毒進行快速檢測和鑒定。［方法］ 通過序列信息比對，設計蘇丹型埃博拉病毒基因保守區(qū)段的擴增引物及測序引物。通過人工方法合成一段基因序列，PCR擴增目的基因片段，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄制備cRNA，RT-PCR擴增目的基因片段，采用焦磷酸測序技術針對目的基因進行保守核苷酸區(qū)段的測序分析。［結果］ 通過序列信息比對尋找到蘇丹型埃博拉病毒基因型的核苷酸保守區(qū)段，經(jīng)焦磷酸測序后能進一步確證毒株的序列信息為蘇丹型埃博拉病毒。經(jīng)過與華大基因公司進行Sanger法測序比較，結果完全一致。［結論］ 基于序列分析的焦磷酸測序技術可以作為進一步確證方法使用。

蘇丹型埃博拉病毒；序列比對；焦磷酸測序

近幾年，外來動物疫病傳入我國的風險不斷上升，隨著小反芻獸疫等外來動物疫病的發(fā)生，非洲豬瘟、尼帕、埃博拉等外來動物疫病步步緊逼我國。至今未查明其自然宿主動物通過與病人接觸或者通過院內(nèi)感染傳播的埃博拉出血熱于1976年首次出現(xiàn)［1］，很快以其高度傳染性的暴發(fā)流行和高度致死性引起研究者極大關注，并引發(fā)了對埃博拉病毒及埃博拉出血熱的一系列研究。

埃博拉出血熱（Ebola hemorrhagic fever， EBHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV ）引起的人類和靈長類嚴重出血熱疾病［2～6］，因EBOV首次是1976年在扎伊爾北部的埃博拉河流附近一個名叫楊博科的小村莊發(fā)現(xiàn)，故命名為埃博拉病毒和埃博拉出血熱。

EBOV 屬絲狀病毒科（Filoviridae），與馬爾堡病毒（Marberg virus） 共同構成絲狀病毒屬（Filovirus）。根據(jù)發(fā)現(xiàn)地點的不同 EBOV 可分為五個亞型，即埃博拉病毒-扎伊爾型（EBOV-Z）、埃博拉病毒-蘇丹型（EBOV-S）、埃博拉病毒-萊斯頓型（EBOV-R）、埃博拉病毒-科特迪瓦型（EBOV-C）［7］和埃博拉病毒-本迪布焦型（EBOV-B）［8］。不同亞型的毒力各不相同，其對人類毒力的強弱順序為：EBOV-Z＞EB0V-S＞EBOV-B＞EBOVC＞EBOV-R［8-9］。其中扎伊爾型、蘇丹型、本迪布焦型、科特迪瓦型對人類有致病性，萊斯頓型僅在非人靈長類中引發(fā)疾病和死亡，人類也可能感染這種病毒從而成為無癥狀的病毒攜帶者［10-11］。世界衛(wèi)生組織已將EBOV列為對人類危害最嚴重的病毒之一，即第4級病毒。試驗操作要求必須在P4級高度安全實驗室中進行［12］。2009年菲律賓發(fā)生豬感染萊斯頓型病毒并傳染給人的疫情［13］，目前，我國尚沒有埃博拉病毒感染或輸入的報道，因此需要高度重視，并做好檢測和防控的技術儲備。

埃博拉病毒可以人-人傳播，對人類危害極大，易被恐怖分子用作生物戰(zhàn)劑?！秶H禁止生物武器公約》已將 EBOV 列為潛在的致死性生物試劑，應引起高度重視。深入研究埃博拉病毒的致病機制及建立埃博拉病毒檢測方法，對預防和控制埃博拉出血熱具有非常重要的意義。

焦磷酸測序技術（Pyrosequencing）是近幾年發(fā)展起來的一種能夠進行定量序列測定的新技術，具有高通量、快速、敏感等特點。目前該技術在物種鑒定、病毒快速鑒定和分型、微生物的檢測等方面已有廣泛的應用［14］。本研究根據(jù)埃博拉病毒基因序列的保守性，建立了埃博拉的PCR-焦磷酸測序檢測方法。

1　材料

1.1材料

蘇丹型埃博拉病毒L基因保守區(qū)段由大連寶生物工程有限公司合成，由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心保存。

1.2主要試劑和儀器

Transcriptor One-Step RT-PCR Kit，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；IDEXX BVDV Ag Serum Plus病原檢測試劑盒購自IDEXX公司；Pyro Gold SQA Reagents 1×96 Pyromark ID購自Biotage AB公司；PyroMark Q96 MD儀器購自QIAGEN。

2　方法

2.1引物設計

選取GenBank中EBOV的毒株及其登錄號Reston Ebola virus（AF522874.1）、Sudan Ebola virus EBOV-S-2004（EU338380.1）、Zaire Ebola virus strain Zaire 1995（AY354458）等100多條核苷酸序列，經(jīng)Megalign比對，選出L基因高度保守且特異核苷酸區(qū)域，運用PSQ Assay Design軟件進行分析，設計一對擴增引物和一條測序引物（表1，2），其中通用引物的下游引物在5端采用生物素標記。引物均由大連寶生物工程技術服務有限公司合成。

表1 擴增引物及序列

表2 測序引物及序列

2.2陽性克隆質(zhì)粒的構建

以合成的L基因為模板，用含有T7啟動子的擴增引物EBOV3/EBOV2（Biotin）擴增EBOV-S L基因保守區(qū)。反應體系為：模板1μL，PCR Mix 25μL，上下游引物各2μL，最后添加滅菌dd H2O至50μL。反應條件為：95℃預變性 5min；94℃變性 30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；72℃延伸7min。預期擴增片段長度為274bp。PCR結束后 ，進行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒切膠回收目的條帶，并克隆到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ecoli JM109感受態(tài)細胞。經(jīng)藍白斑篩選，PCR鑒定獲得含目的基因片段的重組質(zhì)粒，純化后并測序。-20℃保存?zhèn)溆?。

2.3體外轉(zhuǎn)錄

2.3.1體外轉(zhuǎn)錄模板的制備

以構建的陽性克隆質(zhì)粒為模板，T7啟動子的擴增引物EBOV3， EBOV2為引物擴增的目的片段即為體外轉(zhuǎn)錄的模板。反應液用Fermentas公司的普通PCR試劑盒。擴增條件為：95℃預變性5min；94℃30s，56℃ 30s，72℃45s，35個循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像觀察結果。切下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收目的片段，用核酸濃度測定儀定量。

2.3.2體外轉(zhuǎn)錄

用購自Fermentas生物試劑公司TranscriptAid T7 High Yield Transcription kit進行體外轉(zhuǎn)錄，操作步驟按照說明書進行。

2.4RT-PCR擴增

將以上體外轉(zhuǎn)錄模板稀釋100倍，進行RTPCR擴增：體外轉(zhuǎn)錄稀釋的模板1μL，RT-PCR Mix 25μL，EBOV2 2μL，EBOV3 2μL，ddH2O 20μL，總體系50μL。擴增程序為：50℃30min；95℃預變性5min；94℃變性45s，57℃退火45s，72℃延伸45s，擴增35個循環(huán)；最后72℃延伸7min。結果用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，RTPCR產(chǎn)物膠回收后進行濃度測定。

2.5焦磷酸單鏈模板制備

根據(jù)Gene Company Limited公司的焦磷酸測序反應操作說明制備測序單鏈模板。將45μL RTPCR單鏈模板分別加入到PSQ 96板的孔中，并加入測序引物，在85℃的烘箱中放置2min，取出冷卻后就可進行焦磷酸測序。

2.6焦磷酸測序反應

將放有樣品的PSQ96孔板80℃孵育2 min，冷卻至室溫后進行焦磷酸測序反應。將酶混合物、底物混合物和四類核苷酸（A、T、C和G）分別加入試劑艙固定位置。設定程序，將試劑艙和PSQ96孔板放入PSQ TM 96 MD System儀器中中進行測序反應。根據(jù)PSQTM 96MA System儀器的軟件說明在試劑艙中分別加入的底物APS、dNTP和 酶混合物（DNA聚合酶、熒光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）；然后將試劑艙和PSQ 96板放入，進行焦磷酸測序（pyrosequencing）反應。

2.7敏感性試驗

以體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用優(yōu)化好的RT-PCR反應條件進行擴增，取5μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進行濃度測定。將RT-PCR產(chǎn)物進行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍稀釋后，進行焦磷酸測序反應，確定試驗的敏感性。

2.8重復性試驗

將擴增的RT-PCR產(chǎn)物分別進行3次焦磷酸測序，比較每次測得的序列結果，確定試驗的重復性和穩(wěn)定性。

3　結果

3.1PCR擴增結果 利用設計引物擴增埃博拉病毒的特異基因片段，擴增出長度為274bp的目的片段（圖1）。

圖1　蘇丹型埃博拉病毒L基因PCR擴增結果

3.2RT-PCR擴增結果

按RT-PCR程序擴增埃博拉病毒核酸基因材料，所設計的擴增引物能擴增出與設計相符的試驗結果（294 bp）。將反應體系增加到100 μL 以獲得足夠量的目的片斷。擴增后的PCR產(chǎn)物用DNA純化回收試劑盒純化，并送華大基因公司進行Sanger法測序。電泳結果如圖2所示。

圖2　蘇丹型埃博拉病毒L基因RT-PCR擴增結果

3.3焦磷酸測序反應

焦磷酸測序結果按照10（TGAC）堿基順序加入程序進行焦磷酸測序，可很好測得蘇丹型埃博拉病毒L基因的目的片段序列，經(jīng)NCBI的在線BLAST分析確證為蘇丹型埃博拉L基因片段，測序結果完全正確。后經(jīng)在線BIAST分析發(fā)現(xiàn)TGGCAATCAGTTGGACACAl8個堿基的一段序列即可達到對埃博拉病毒的鑒定目的（圖3）。

圖 3 蘇丹型埃博拉病毒L基因焦磷酸測序圖譜結果

3.4敏感性鑒定結果

將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板的RT-PCR產(chǎn)物稀釋8個梯度，即2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍稀釋，稀釋后進行焦磷酸測序。結果證實本方法的敏感性為102.8EID50，仍然能夠成功測出靶序列（圖略）。

3.5重復性試驗結果

對每個RT-PCR產(chǎn)物進行3次重復性檢測，檢測的結果均一致，證明該方法有很好的重復性與穩(wěn)定性。

4　討論

埃博拉病毒有著感染性極強，致死率極高的特點，致死率可達50%～90%［15］。對人類健康危害很大。世界動物衛(wèi)生組織已將埃博拉病毒列為對人類危害最嚴重的病毒之一。尤其當今社會恐怖活動日益增多，不排除用EBOV制作生化武器的可能。因此我們應該高度重視EBOV，著手于早期防控工作［16］。

目前針對類似埃博拉出血熱這樣的突發(fā)性烈性傳染性疾病，我們應及早確定病毒傳染源，將有利于做出早期診斷，隔離傳染源，切斷傳播途徑，阻止疫情進一步迅速擴大。輔助流行病學調(diào)查的實驗診斷手段將提供更可靠的研究典范。本次研究就是生物信息學分析結合應用先進實驗手段的一個例子，它的應用價值在于PSQ 技術是一種比較新穎的技術，（1）它可以專門對預測的突變位點進行檢測，避免了全基因測序；（2）本研究以生物信息學研究為基礎，結合PSQ 技術，建立了通過核酸多態(tài)性特征確定萊斯頓型埃博拉病毒株的快速鑒定方法，對于突發(fā)埃博拉事件是很好的快速應急鑒定方法；（3）通過本研究證實上海獸醫(yī)研究所送檢樣品為埃博拉陰性，對于流行病學調(diào)查提供了有力證據(jù)。其它流行性疾病也可以用類似方法追查其傳染源，控制疾病傳播，對于流行性疾病的控制有很大幫助。

本實驗所建立的PCR-焦磷酸測序檢測EBOV-S的方法體現(xiàn)了該方法準確性高、重復性 好、自動化程度高、低成本、靈敏度高、高通量等優(yōu)點，可一次性檢測96份樣品，有望成為一種快速檢測病原的技術。本試驗發(fā)現(xiàn)，在測序反應中，將測序引物濃度從0.3M調(diào)至0.6M時，能得到峰值更高的圖形與結果。

焦磷酸測序技術（pyrosequencing）是近年發(fā)展起來的一種能夠通過對基因序列測序?qū)崿F(xiàn)檢測和確診的新型檢測技術，具有高通量、快速、敏感等特點［17］，其基本原理是設計帶有生物素標記的擴增引物，通過PCR反應生成含有生物素標記的目的基因片段，然后制備測序單鏈模板。將待測單鏈模板與測序引物雜交結合，放入PSQTM 96MD System中進行測序反應。與普通RT-PCR和real time RT-PCR等檢測技術相比，本技術無需將PCR產(chǎn)物電泳及無需送交公司測序以便確診，從而大大減少了病原確診時間。焦磷酸測序操作簡單方便，可程序化，便于構建標準化操作流程和規(guī)范，從而保證試驗結果的穩(wěn)定性和準確性［18］。蘇丹型埃博拉病毒焦磷酸測序方法的建立為今后動物疫病檢測技術的研究提供了新的思路。

［1］ Towner J S， Rollin D G， Bausch D G， et al. Rapid diagnosis of Ebola hemorrhagic fever by reverse transcription-PCR in an outbreak setting and assessment of patient viral load as a predictor of outcome［J］.J Virol，2004，78（8）：4330-4341.

［2］ 殷震，劉景化.動物病毒學［M］.2版.北京：科學出版社，1997，773-776.

［3］ 任金法. 致命的埃博拉病毒?。跰］//中國現(xiàn)代醫(yī)學理論與實踐.北京：中國環(huán)境科學出版社，1998，1309-1311.

［4］ 劉沛.埃博拉出血熱研究現(xiàn)狀［J］.臨床內(nèi)科雜志，2005，22（8）：5l4-5l6.

［5］宋干.埃博拉出血熱研究進展［J］.中國人獸共患病雜志，1997，13（2）：5l-53.

［6］ 陳化新，唐瀏英.埃博拉出血熱的研究進展［J］.臨床內(nèi)科雜志，2000，17（4）：201-203.

［7］Weidmann M， Muhlberger E， Hufert F T. Rapid detection protocol for fi loviruses［J］.J Clin Virol，2004，30（1）：94-99.

［8］Towner J S， Sealy T K， Khristova M L，et al. Newly discovered Edola virus associated with hemorrhagic fever outbreak in Uganda［J］.PLoS Pathog，2008，4（11）：e1000212.

［9］楊濤，尹文.埃博拉病毒的研究概況［J］.國外醫(yī)學：病毒學分冊，2002，9（5）：152-155.

［10］Fisher-Hoch S P， Brammer T L， Trappier S G， et al. Pathogenic potential of fi loviruses∶ role of geographic origin of primate host and virus strain［J］.J Infect Dis，1992，166（4）：753-63.

［11］Hartman A L， Towner J S， Nichol S T. Ebola and Marburg hemorrhagic fever［J］.Clin Lab Med，2010，30（1）：161-177.

［12］張海軍.埃博拉病毒及埃博拉?。跩］.生物教學， 2001，26（8）：1.

［13］Barrette R W， Metwally S A， Rowland J M， et al. Discovery of swine as a host for the Reston Ebolavirus［J］. Science，2009，325（5937）：204-206.

［14］陳之遙，周國華.焦測序技術的研究進展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2008，8（8）：1573-1576.

［15］Mason C. The strains of Ebola［J］.CMAJ，2008，178（10）：1266-1267.

［16］Geisbert T W， Jabrling P B. Towards a vaccine against Ebola virus［J］.Expert Rev Vaccines，2003，2（6）：777-789.

［17］ Elahi E， Ronaghi M. Pyrosequencing：a tool for DNA sequencing analysis［J］.Methods in Molecular Biology，2004，255：211-219.

［18］Tschentscher F，Ulrich H，F(xiàn)rey U H， et al. Amelogenin sex determination by pyrosequencing of short PCR products［J］.Int J Legal Med，2008，122（4）：333-335

（責任編輯：胡藕祥）

Establishment of Pyrosequencing Assay for Detection of Sudan Ebola Virus

Zhao Yonggang，Zou Yanli ，Zhang Yongqiang，Wu Xiaodong ，Wang Qinghua，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

［Objective］ To establish a new molecular method for simultaneous and rapid detection and confi rmation of Ebola virus by using sequence analysis combined with pyrosequencing technology. ［Methods］ Amplifi cation primers and a sequencing primer were designed according to the published sequences of conserved L gene regions of three Sudan Ebola viruses in GenBank. A gene sequence was synthesized artifi cially， and the target gene were amplifi ed by PCR， to prepare cRNA through in vitro transcription. RT-PCR was developed for conserved regions of the gene， and the RT-PCR products were pysrosequenced.［Results］ The characterized nucleotide segment was obtained by sequence analysis， and then the segment was confi rmed as Sudan Ebola virus. Compared to the Sanger method of Huada， they showed 100% agreement.［Conclusion］ Pyrosequencing technology based on sequence analysis can be used to confi rm Sudan Ebola virus.

Sudan type EBOV virus；sequence comparison；pyrosequencing

S852.65+9.5

A

1005-944X（2015）09-0077-05