孫秀文 李冰 張偉剛 黨二樂 晉亮 王剛

·論著·

銀屑病患者皮損和外周血中CD8α+α+T 細(xì)胞的研究

孫秀文 李冰 張偉剛 黨二樂 晉亮 王剛

目的 觀察銀屑病患者皮損和外周血中CD8α+α+T細(xì)胞的分布和比例，探討其在銀屑病發(fā)病中的作用。方法 采用免疫熒光技術(shù)觀察5例進(jìn)展期尋常性銀屑病患者和5例健康人皮膚中CD8α+α+T細(xì)胞的分布，流式細(xì)胞儀分別檢測10例進(jìn)展期尋常性銀屑病患者和8例健康人外周血中CD8α+α+T細(xì)胞比例及干擾素γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)。采用Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)組和對照組各數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果 在5例銀屑病患者皮損真皮淺層均可見以CD8α+α+T細(xì)胞為主的浸潤，未見明顯的CD8α+β+T細(xì)胞浸潤；而5例健康人皮膚中均未見CD8α+α+T細(xì)胞和CD8α+β+T細(xì)胞浸潤。流式細(xì)胞儀檢測，8例健康人外周血中CD8α+α+T細(xì)胞比例為9.12%±4.80%，10例銀屑病患者組為26.47%±12.99%，銀屑病患者組明顯高于對照組，兩組比較，t=3.96，P＜0.001。在銀屑病患者外周血CD8α+α+T細(xì)胞中分泌IFN-γ和TNF-α的細(xì)胞比例分別為47.36%±19.38%和54.14%±21.14%，健康對照組分別為13.44%±9.21%和34.03%±17.22%，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為4.54和2.17，P值分別＜0.001和＜0.05）。結(jié)論 銀屑病患者皮損和外周血中存在CD8α+α+T細(xì)胞的分布和比例增多，CD8α+α+T細(xì)胞可能是參與銀屑病發(fā)病的主要CD8+T細(xì)胞亞群。

銀屑?。籆D8陽性T淋巴細(xì)胞；干擾素γ；腫瘤壞死因子α

目前認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞活化及其分泌的促炎因子是銀屑病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［1］。以往的研究認(rèn)為，CD4+T細(xì)胞是銀屑病炎癥因子的主要來源［2］。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，γδT細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞也會分泌大量炎癥因子參與各種自身免疫性疾病發(fā)?。?-4］。隨著對CD8+T細(xì)胞亞群認(rèn)識地逐漸深入，發(fā)現(xiàn)不同的CD8+T亞群在感染、腫瘤及自身免疫性疾病中的作用也不同。目前認(rèn)為，CD8α+β+T細(xì)胞主要是殺傷性T 細(xì)胞，而 CD8α+α+T 細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子［5］。有研究報(bào)道，CD8+T細(xì)胞可以通過分泌炎癥因子參與銀屑病發(fā)?。?］，但其亞群在銀屑病發(fā)病中的作用及機(jī)制仍未明確。我們采用免疫熒光技術(shù)及流式細(xì)胞分析法對尋常性銀屑病患者皮損及外周血CD8α+α+T細(xì)胞的表達(dá)及分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行分析。

材料與方法

一、臨床資料

收集2013年9月至2014年4月我科門診10例進(jìn)展期尋常性銀屑病患者外周血，所有患者1個(gè)月內(nèi)未使用藥物治療；收取8例健康志愿者外周血作為對照組，患者及健康志愿者1個(gè)月內(nèi)均未患上呼吸道感染等感染性疾病。10例患者中男6例，女4例，年齡18～55歲，平均37歲；8例健康志愿者中男5例，女3例，年齡20～55歲，平均35歲。5例進(jìn)展期尋常性銀屑病患者皮損來源于活檢手術(shù)取材，5例健康對照組皮膚來源于植皮術(shù)修剪剩余皮膚。皮損與外周血檢測為同組患者。本研究經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。

二、材料

兔抗人CD8α單抗、鼠抗人CD8β多抗為美國abcam公司產(chǎn)品，單克隆抗體鼠抗人CD8α PECyanine 5、CD8β PE-Cyanine 7、固定/通透稀釋劑、固定/通透濃縮劑、通透緩沖液10×和細(xì)胞因子刺激劑為美國eBioscience公司產(chǎn)品，單克隆抗體鼠抗人干擾素 γ（IFN-γ）FITC、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）Alexa Fluor 488為美國BioLegend公司產(chǎn)品。

三、方法

1.免疫熒光：取銀屑病患者皮損進(jìn)行4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟至水，并將切片浸入3%H2O2封閉液封閉；高壓修復(fù)；滴加稀釋后的一抗 50 μl，4℃過夜；第 2天室溫復(fù)溫 1 h，滴加二抗復(fù)合物，每張切片50 μl，室溫放置45 min；洗滌液沖洗；滴加DAPI復(fù)合物，室溫放置10 min；洗滌液反復(fù)沖洗，甘油封片。激光共聚焦方法進(jìn)行圖像采集。

2.淋巴細(xì)胞分離：抽取靜脈血5 ml，肝素抗凝，與等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻，加入到等體積的淋巴細(xì)胞分離液離心管中，離心，取中間淋巴細(xì)胞層，加PBS溶液離心，棄上清；加入紅細(xì)胞裂解液5 min，加入PBS溶液終止，離心，棄上清；用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)，置入6孔板中備用。

3.流式細(xì)胞鑒定：收集6孔板中的外周血單一核細(xì)胞于無菌流式管中吹勻，離心，棄上清；加入1 ml含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基混勻，并加2 μl細(xì)胞因子刺激劑混勻，37℃孵箱中封閉4 h；1.5 ml流式洗滌液離心，棄上清，加入100 μl流式洗滌液吹勻，加入CD8α和CD8β抗體，并設(shè)相應(yīng)的單標(biāo)，4℃避光30 min；加入1.5 ml流式洗滌液離心，棄上清，加入按3∶1稀釋的固定/通透稀釋劑和固定/通透濃縮劑 200 μl，室溫避光 30 min；加入 1.5 ml流式洗滌液離心，棄上清，并重復(fù)1次，加以通透緩沖液10×與PBS按1∶9稀釋后的液體1 ml，混勻，離心，棄上清，加IFN-γ及TNF-α抗體，4℃避光2 h；加入1.5 ml流式洗滌液離心，棄上清，加入固定液200 μl混勻，上流式細(xì)胞儀檢測。

4.統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)以±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、銀屑病皮損中CD8α+α+T細(xì)胞的分布

5例銀屑病患者皮損表皮及真皮淺層均可見以CD8α+α+T 細(xì)胞為主的浸潤，未見明顯的 CD8α+β+T細(xì)胞浸潤；而5例健康人皮膚中均未見CD8α+α+T細(xì)胞和CD8α+β+T細(xì)胞浸潤。見圖1。

二、銀屑病患者外周血CD8α+α+T細(xì)胞比例

流式細(xì)胞儀檢測10例進(jìn)展期尋常性銀屑病患者和8例健康人外周血中CD8α+α+T細(xì)胞比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康對照組外周血CD8α+α+T細(xì)胞比例為9.12%±4.80%，銀屑病患者組為26.47%±12.99%，兩組比較，t=3.96，P ＜ 0.001。見圖 2。

三、銀屑病患者外周血CD8α+α+T細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子的表達(dá)

在進(jìn)展期尋常性銀屑病患者外周血CD8α+α+T細(xì)胞中分泌IFN-γ和TNF-α的細(xì)胞比例分別為47.36%±19.38%和54.14%±21.14%，健康對照組分別為13.44%±9.21%和34.03%±17.22%，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為4.54和2.17，P值分別＜0.001和＜0.05）。見圖3。

討 論

銀屑病是多基因遺傳背景介導(dǎo)下的慢性炎癥性疾病，嚴(yán)重影響患者的身心健康，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明［6］?，F(xiàn)普遍認(rèn)為，T細(xì)胞是銀屑病免疫紊亂形成的主導(dǎo)者，其異?；罨倾y屑病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［7］。T細(xì)胞活化后，釋放大量的炎癥因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-17等，參與銀屑病的發(fā)生及發(fā)展［8］。

圖1 免疫熒光檢測尋常性銀屑病患者皮損CD8α及CD8β表達(dá)情況（×20） 健康人皮膚全層未見CD8α及CD8β陽性T細(xì)胞浸潤，銀屑病患者皮損可見CD8α陽性T細(xì)胞浸潤及散在CD8β陽性T細(xì)胞，以真皮淺層為主

圖2 流式細(xì)胞儀檢測健康人8例與尋常性銀屑病患者10例外周血中CD8α+α+T細(xì)胞比例 與健康對照組相比，銀屑病患者外周血中CD8α+α+T細(xì)胞比例明顯增高 2A：對照組和銀屑病患者組外周血中CD8α+α+T細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果；2B：對照組和患者組CD8α+α+T細(xì)胞和CD8α+β+T細(xì)胞的構(gòu)成比

圖3 流式細(xì)胞儀檢測健康人8例與尋常性銀屑病患者10例外周血CD8α+α+T細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子的表達(dá) 銀屑病患者外周血中CD8α+α+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ和TNF-α的水平均明顯高于健康對照組

CD8+T細(xì)胞起源于骨髓，在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟，成熟后隨著淋巴循環(huán)到達(dá)全身各處，外周CD8+T細(xì)胞主要分布在脾臟、扁桃體和淋巴結(jié)等器官中［9］。T細(xì)胞表面CD8分子主要參與TCR的親和力調(diào)控。功能性CD8分子是由CD8α鏈和CD8β鏈形成的異源或同源二聚體，據(jù)此CD8+T細(xì)胞可分為CD8α+α+T細(xì)胞與CD8α+β+T細(xì)胞兩個(gè)亞型，且其功能有著顯著的差別［5］。CD8αβ能夠提高TCR的親合力，CD8αα可以降低TCR的抗原敏感性［5］。以往，學(xué)者們普遍認(rèn)為，CD8α+α+T細(xì)胞具有負(fù)向免疫調(diào)控作用。然而，近期 Zhu 等［10］發(fā)現(xiàn)，CD8α+α+T 細(xì)胞長期定位在生殖器皮膚和黏膜內(nèi)，發(fā)揮著免疫監(jiān)控功能，抑制病毒感染，對生殖器皰疹的復(fù)發(fā)發(fā)揮著重要的抑制作用；皰疹皮損愈合后，皮損局部CD8α+β+T細(xì)胞被完全清除，而CD8α+α+T細(xì)胞可在局部持續(xù)存在。

以往研究認(rèn)為，銀屑病炎癥因子主要來源于CD4+輔助性 T 細(xì)胞（Th）［11-12］。近年研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病中也發(fā)揮著重要的作用［13］，銀屑病患者皮損中可見CD8+T細(xì)胞浸潤［4］。銀屑病中CD8+T 細(xì)胞可通過分泌 IL-17、IL-21、IFN-γ 及TNF-α等細(xì)胞因子參與疾病的發(fā)病［14］。但是哪一類CD8+T細(xì)胞亞群在銀屑病發(fā)病中發(fā)揮致病作用及其機(jī)制尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，銀屑病患者外周血中CD8α+α+T細(xì)胞比例明顯升高。此外，銀屑病患者CD8α+α+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ和TNF-α水平均明顯增高。該研究發(fā)現(xiàn)，CD8α+α+T細(xì)胞亞群通過分泌炎癥因子參與銀屑病發(fā)病，明確了CD8+T細(xì)胞亞群在銀屑病發(fā)病中作用。此外，該研究發(fā)現(xiàn)了銀屑病患者CD8α+α+T細(xì)胞的促炎作用，拓展并完善了對CD8+T細(xì)胞亞群及其功能的認(rèn)識，為CD8+T細(xì)胞在自身免疫病及炎癥性疾病中的作用研究提供了新思路。

［1］Michalak-StomaA,PietrzakA,SzepietowskiJC,etal.Cytokinenetwork in psoriasis revisited［J］.Eur Cytokine Netw,2011,22（4）:160-168.

［2］Valdimarsson H,Thorleifsdottir RH,Sigurdardottir SL,et al.Psoriasis--as an autoimmune disease caused by molecular mimicry［J］.Trends Immunol,2009,30（10）:494-501.

［3］Stepanova K,Sinkora M.Porcine γδ T lymphocytes can be categorized into two functionally and developmentally distinct subsetsaccording to expression of CD2 and level of TCR ［J］.J Immunol,2013,190（5）:2111-2120.

［4］Hijnen D,Knol EF,Gent YY,et al.CD8+T cells in the lesional skin of atopic dermatitis and psoriasis patients are an important source of IFN-γ,IL-13,IL-17,and IL-22 ［J］.J Invest Dermatol,2013,133（4）:973-979.

［5］Cheroutre H,Lambolez F.Doubting the TCR coreceptor function of CD8αα［J］.Immunity,2008,28（2）:149-159.

［6］王剛.銀屑病研究熱點(diǎn)［J］.中華皮膚科雜志,2013,46（3）:153-156.

［7］Perera GK,Di Meglio P,Nestle FO.Psoriasis［J］.Annu Rev Pathol,2012,7:385-422.

［8］Lewis BJ,Rajpara S,Haggart AM,et al.Predominance of activated,clonally expanded T helper type 17 cells within the CD4+T cell population in psoriaticlesions［J］.Clin Exp Immunol,2013,173（1）:38-46.

［9］金伯泉,曹雪濤,熊思東.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2013:83-92.

［10］Zhu J,Peng T,Johnston C,et al.Immune surveillance by CD8αα+skin-resident T cells in human herpes virus infection ［J］.Nature,2013,497（7450）:494-497.

［11］Sugiyama H,Gyulai R,Toichi E,et al.Dysfunctional blood and target tissue CD4+CD25high regulatory T cells in psoriasis:mechanism underlyingunrestrained pathogenic effector T cell proliferation［J］.J Immunol,2005,174（1）:164-173.

［12］Yates J,Rovis F,Mitchell P,et al.The maintenance of human CD4+CD25+regulatory T cell function:IL-2,IL-4,IL-7 and IL-15 preserve optimalsuppressive potencyin vitro ［J］.Int Immunol,2007,19（6）:785-799.

［13］Teunissen MB,Yeremenko NG,Baeten DL,et al.The IL-17A-producing CD8+T-cell population in psoriatic lesional skin comprises mucosa-associated invariant T cells and conventional T cells［J］.J Invest Dermatol,2014,134（12）:2898-2907.

［14］Ortega C,Fernández-AS,Carrillo JM,et al.IL-17-producing CD8+T lymphocytes from psoriasis skin plaques are cytotoxic effector cells that secrete Th17-related cytokines［J］.J Leukoc Biol,2009,86（2）:435-443.

第六屆全國深部真菌感染學(xué)術(shù)會議征文通知

全國深部真菌感染學(xué)術(shù)會議是由感染、呼吸、血液、皮膚、重癥醫(yī)學(xué)等多學(xué)科權(quán)威專家于2005年共同組織發(fā)起的，旨在為深部真菌研究人員提供一個(gè)溝通和交流的平臺，真正實(shí)現(xiàn)多學(xué)科協(xié)作與交流。第六屆會議定于2015年11月27－29日在安徽合肥召開，由國家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心主辦。會議將邀請國內(nèi)外知名專家就深部真菌感染的流行病學(xué)、臨床診治以及病案討論等最新研究成果展開交流與討論。同時(shí)歡迎從事相關(guān)研究的學(xué)者踴躍投稿參會。

征文內(nèi)容：①深部真菌感染的病原學(xué)、流行病學(xué)、組織病理學(xué)、發(fā)病機(jī)制等基礎(chǔ)研究；②深部真菌感染的診斷學(xué)，包括實(shí)驗(yàn)室診斷和影像學(xué)診斷；③深部真菌感染的臨床診治研究；④抗真菌藥物研究；⑤典型病例討論。

征文要求：投稿請?zhí)峁┱撐恼瑧?yīng)包括研究目的、材料和方法、結(jié)果、結(jié)論，字?jǐn)?shù)400～800字。截稿日期：2015年9月30日。

論文評審：組委會邀請權(quán)威專家對論文進(jìn)行評審，優(yōu)秀論文將頒發(fā)獲獎(jiǎng)證書并給予一定的獎(jiǎng)勵(lì)，部分優(yōu)秀論文可推薦至相關(guān)專業(yè)雜志發(fā)表。

會議注冊及學(xué)分：參會代表可授予國家級繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育項(xiàng)目Ⅰ類學(xué)分10分。

投稿郵箱：sbzj2015@163.com，官方微信號：fungalinfection，聯(lián)系人：馬立英，電話/傳真：010－65041809/65005315。

CD8α+α+T cells in lesions and peripheral blood of patients with psoriasis

Sun Xiuwen,Li Bing,Zhang Weigang,Dang Erle,Jin Liang,Wang Gang.Department of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China

Wang Gang,Email:xjwgang@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the distribution and proportion of CD8α+α+T cells in lesions and peripheral blood of patients with psoriasis,and to assess their roles in the pathogenesis of psoriasis.Methods An immunofluorescence assay was performed to observe the distribution of CD8α+α+T cells in lesions of 5 patients with progressive psoriasis vulgaris and normal skin of 5 healthy human controls.Flow cytometry was conducted to determine the proportion ofCD8α+α+T cells,and to measure the expressions of interferon（IFN）-γ and tumor necrosis factor（TNF）-α in peripheral blood from 10 patients with progressive psoriasis vulgaris and 8 healthy human controls.Statistical analysis was carried out byttest with GraphPad Prism software.ResultsA massive infiltrate mainly composed of CD8α+α+T cells but not CD8α+β+T cells was observed in the upper dermis of lesions from the 5 patients with psoriasis,while there was no infiltrate of CD8α+β+or CD8α+α+T cells in the normal skin of 5 healthy human controls.Flow cytometry revealed that the proportion of CD8α+α+T cells was significantly higher in peripheral blood from 10 patients with psoriasis than in that from 8 healthy human controls（26.47%±12.99%vs.9.12%±4.80%,t=3.96,P＜0.001）.Significant differences were also noted between the psoriatic patients and healthy human controls in the percentage of cells secreting IFN-γ（47.36% ±19.38%vs.13.44% ±9.21%,t=4.54,P＜0.001）and cells secreting TNF-α （54.14% ±21.14%vs.34.03% ± 17.22%,t=2.17,P ＜ 0.05）in peripheral blood CD8α+α+T cells.ConclusionsBoth the distribution and proportion of CD8α+α+T cells are increased in lesions and peripheral blood from patients with psoriasis,suggesting that CD8α+α+T cells may be the main subgroup of CD8+T cells that contribute to the pathogenesis of psoriasis.

Psoriasis;CD8-positive T-lymphocytes;Interferon-gamma;Tumor necrosis factor-alpha

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.003

國家自然科學(xué)基金（81171494）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院

王剛，Email：xjwgang@fmmu.edu.cn

2014-06-19）

（本文編輯：顏艷）