張翠彩，徐建民，李秀文，曹志強(qiáng)，蔣秀高

2.江西省疾病預(yù)防控制中心，南昌 330029

鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體引起的一種人獸共患病。鉤端螺旋體的傳統(tǒng)分類方法依賴于血清學(xué)分類，其采用暗視野顯微凝集試驗(yàn)（The microscopic agglutination test，MAT）確定血清群，進(jìn)一步采用凝集交叉吸收試驗(yàn)（Cross Agglutinin Absorption Test，CAAT）確定血清型。鉤端螺旋體的血清型別極其復(fù)雜，目前世界上流行的主要致病性鉤端螺旋體可多達(dá)300多個(gè)血清型，隸屬于至少25個(gè)血清群。開展傳統(tǒng)的血清學(xué)分類方法，需要提前準(zhǔn)備一系列的標(biāo)準(zhǔn)菌株或者標(biāo)準(zhǔn)血清，該試驗(yàn)方法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，只有在有條件的參考實(shí)驗(yàn)室方可開展，因此，對(duì)于鉤端螺旋體的分型分析在基層實(shí)驗(yàn)室受到很大的限制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，多位點(diǎn)序列分析（Multilocus sequence typing，MLST）逐漸被應(yīng)用于病原體分子流行病學(xué)研究，該方法簡便快捷，不需要培養(yǎng)大量活菌，只需少量的DNA即可，結(jié)果數(shù)字化可進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)室間的對(duì)比分析。目前，MLST可較好的應(yīng)用于鉤端螺旋體基因分型、流行病學(xué)溯源、種群結(jié)構(gòu)、親緣進(jìn)化關(guān)系分析等研究［1］。近年來，黃疸出血群是中國鉤端螺旋體病的主要致病性血清群［2］。本研究選取近年來我國四川、江西、湖南三個(gè)省份39株致病性黃疸出血群鉤端螺旋體菌株，采用MLST方法進(jìn)行基因分型分析，初步探討我國致病性鉤端螺旋體的分子流行病學(xué)、種群結(jié)構(gòu)、親緣進(jìn)化關(guān)系等特征。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 本研究共選用黃疸出血群致病性鉤端螺旋體菌株39株，分別來自于四川、江西、湖南3個(gè)省市的2006～2008年菌株。

1.2 主要試劑PCR Premix購自寶生物工程（大連）有限公司；100bp DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司；基因組提取采用硅膠膜型TM基因組DNA提純?cè)噭┖校徸员本┵惏偈⒒蚣夹g(shù)有限公司。

1.3 菌體DNA制備 采用EMJH液態(tài)培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7～10d，在對(duì)數(shù)生長期對(duì)菌體提取DNA，操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 MLST位點(diǎn)的選擇及PCR擴(kuò)增 參考2013年Boonsilp等報(bào)道的國際通用MLST研究方案［1］，選用7個(gè)管家基因位點(diǎn)pntA、sucA、pfkB、tpiA、mreA、gluM、caiB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各位點(diǎn)信息見表1，引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。采用20μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增檢，Premix Ex Taq10.0μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板1μL，純水補(bǔ)充至20μL反應(yīng)體積。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃ 預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

表1 MLST分析中7個(gè)位點(diǎn)引物信息Tab.1 Primers of seven loci in MLST analysis

1.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)、測(cè)序、序列拼接 擴(kuò)增產(chǎn)物陽性者直接純化、測(cè)序，采用雙向測(cè)通方法，由寶生物工程（大連）有限公司完成。利用contig軟件進(jìn)行序列檢查、拼接，采用DNAStar軟件中的MegAlign模塊進(jìn)行序列截取。

1.6 數(shù)據(jù)分析 將7個(gè)管家基因位點(diǎn)序列與MLST網(wǎng)站http：//www.mlst.net/上相應(yīng)等位基因進(jìn)行比較，獲得每株菌的等位基因譜（gluM－pntA－sucA－tpiA－pfkB－mreA－caiB），確 定 序 列 的ST型別。應(yīng)用eBURST軟件分析各ST型別間的種群結(jié)構(gòu)及親緣進(jìn)化關(guān)系。利用BioNumerics軟件進(jìn)行聚類分析，觀察菌株間的基因多態(tài)性情況。

2 結(jié) 果

2.1 MLST中7個(gè)位點(diǎn)等位基因情況 經(jīng)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，39株黃疸出血群菌株中，7個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性尚可，等位基因數(shù)目介于2～4之間，mreA位點(diǎn)多態(tài)性最高，呈現(xiàn)出4個(gè)等位基因，glmU位點(diǎn)的多態(tài)性最低，為2個(gè)等位基因，見表2。

2.2 基因多態(tài)性分析 MLST基因分型分析發(fā)現(xiàn)，39株黃疸出血群鉤端螺旋體菌株呈現(xiàn)5個(gè)ST型別，其中ST1為主要的優(yōu)勢(shì)ST型別，占53.85%（21/39），其次依次為 ST143占 17.95%（7/39）、ST128占12.82%（5/39）、ST17占12.82%（5/39）、ST209占2.56%（1/39）。地區(qū)間ST 分布不盡相同，四川、江西地區(qū)以ST1為優(yōu)勢(shì)型別，湖南地區(qū)以ST128為主要優(yōu)勢(shì)型別，詳見表3。

表2 MLST中每個(gè)位點(diǎn)的等位基因情況Tab.2 Number of unique alleles at each locus in MLST analysis

表3 39株黃疸出血群鉤端螺旋體菌株ST型別情況Tab.3 Number of sequence types（STs）for 39 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhag isolates

2.3 eBURST軟件分析 結(jié)果顯示：39株菌株分為2個(gè)Clonal complexes和1個(gè)singleton，見圖1。其中Group1占66.67%（26/39），包含ST1、ST128兩個(gè)ST型別，來自于四川、江西、湖南三個(gè)地區(qū)；Group2占20.51%（8/39），包含 ST143、ST209兩個(gè)ST型別，全部來自于2006～2007年江西菌株；一個(gè)單獨(dú)的 singleton，占 12.82%（5/39），僅由ST17組成，全部來自于2007～2008年江西菌株，該singleton與其他兩個(gè)Group親緣進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，為一個(gè)獨(dú)立的克隆群。

圖1 39株黃疸出血群鉤端螺旋體eBURST分析Fig.1 eBURST analysis of 39 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhag isolates

2.4 BioNumerics軟件分析 采用UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)：39株菌株共分為3個(gè)Group群5種基因型，見圖2。UPGMA聚類圖中的分群結(jié)構(gòu)與eBURST分析結(jié)果一致。Group1包括ST128和ST1共2種基因型；Group2包括ST143和ST209共2種基因型，全部為2006～2007年江西菌株；Group3包括ST17僅1種基因型，全部為2007～2008年江西菌株。由聚類圖顯示：ST1同時(shí)分布于四川、江西、湖南三個(gè)地區(qū)，為本研究中南方地區(qū)的優(yōu)勢(shì)ST型別；ST143、ST209和ST17三個(gè)ST型別僅分布在江西地區(qū)；而ST128僅分布于湖南地區(qū)，因此在一定程度上MLST基因型別存在明顯的地域性差異。

圖2 39株黃疸出血群鉤端螺旋體UPGMA聚類分析Fig.2 UPGMA dendrogram of 39 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhag isolates

3 討 論

多位點(diǎn)序列分析（MLST），主要應(yīng)用于菌株種群結(jié)構(gòu)、親緣進(jìn)化關(guān)系、流行病學(xué)溯源等研究領(lǐng)域。黃疸出血群是中國鉤端螺旋體病的主要致病性血清群，占?xì)v年來所發(fā)病例的60%以上［2］。本研究采用MLST技術(shù)對(duì)我國四川、江西、湖南三個(gè)地區(qū)2006～2008年的39株黃疸出血群鉤端螺旋體菌株進(jìn)行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性較好，39株分離株呈現(xiàn)3個(gè)克隆群5種ST型。

有MLVA研究報(bào)道，細(xì)菌基因型與地理分布有一定的相關(guān)性［3］。在本次MLST研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)MLST基因型呈現(xiàn)一定的地域性特征，而同一地區(qū)內(nèi)部菌株的ST型別相似性度較高。由聚類圖顯示：ST1為本研究中南方三個(gè)省份的優(yōu)勢(shì)ST型別，占53.85%（21/39），與李世軍等［4］2012年報(bào)道分離自貴州的3株黃疸出血群菌株均為ST1型別相一致，推測(cè)可能ST1型別在外界氣候、自然環(huán)境以及宿主環(huán)境變遷中具有較好的生存優(yōu)勢(shì)，因而普遍分布于南方多個(gè)省份。從不同地區(qū)ST型別多態(tài)性來看，存在明顯的地域性差異。四川、湖南的ST型別相對(duì)單一，四川地區(qū)僅呈現(xiàn)ST1一種型別，湖南地區(qū)僅呈現(xiàn)ST128和ST1兩種ST型別，eBURST種群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：ST128和ST1均隸屬于Group1克隆群，親緣進(jìn)化關(guān)系較近，而江西地區(qū)的ST型別多態(tài)性較高，呈現(xiàn)出ST1、ST17、ST143、ST209共四個(gè)型別，48.15%（13/27）的江西菌株隸屬于Group2和一個(gè)單獨(dú)的singleton，與Group1的親緣進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。地區(qū)間ST型別的差異可能是由于菌株的自身遺傳變異與當(dāng)?shù)貐^(qū)域性的氣候、環(huán)境變遷存在一定的相關(guān)性，具體的原因還有待進(jìn)一步的深入研究驗(yàn)證。Voronina等［5］2014年對(duì)來自于俄國的11株黃疸出血群菌株進(jìn)行MLST研究，共發(fā)現(xiàn)ST17、ST199、ST23和ST206四種ST型別。Romero等［6］2011年對(duì)1986～2009年間法國圣保羅地區(qū)的90株黃疸出血群菌株研究發(fā)現(xiàn)，只呈現(xiàn)ST17一種ST型別。Caimi等［7］2012年對(duì)1993～2005年間阿根廷的3株黃疸出血群菌株進(jìn)行基因分型研究，僅發(fā)現(xiàn)ST17一種ST型別。綜合國內(nèi)、國際ST型別研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國黃疸出血群菌株基因多態(tài)性較高，除ST17作為優(yōu)勢(shì)型別在中國及世界其他多個(gè)國家廣泛分布外，某些國家仍存在一些獨(dú)特的ST型別，呈現(xiàn)一定程度的地理分布特征。

Thaipadungpanit等［8］對(duì)泰國東北部2000～2005年的鉤體疫情進(jìn)行MLST研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ST34為主要的優(yōu)勢(shì)克隆群，隸屬為秋季群菌株，提示MLST分型方法可作為流行病學(xué)溯源的有力工具。本研究的菌株主要來自于中國鉤端螺旋體病國家級(jí)哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)現(xiàn)場，涉及的菌株為流行病學(xué)非關(guān)聯(lián)的監(jiān)測(cè)菌株，本研究中之所以每個(gè)地區(qū)內(nèi)部的ST型別高度相似，可能是由于當(dāng)年的分離菌株均來自于同一時(shí)間同一個(gè)監(jiān)測(cè)現(xiàn)場，宿主棲息生存的自然環(huán)境極其相似，因而在分子遺傳水平上高度相似，該MLST方法是否可進(jìn)一步應(yīng)用于鉤體病的流行病學(xué)溯源，尚需要適當(dāng)數(shù)量的疫情暴發(fā)關(guān)聯(lián)菌株來進(jìn)一步驗(yàn)證。

通過本次基因分型研究發(fā)現(xiàn)，目前國際通用的MLST方案可初步應(yīng)用于中國致病性鉤端螺旋體的基因多態(tài)性、種群結(jié)構(gòu)分析。雖然MLST在中國的應(yīng)用還處于初級(jí)階段，尚需要擴(kuò)大適當(dāng)數(shù)目的菌株量來驗(yàn)證其實(shí)用性，但是與傳統(tǒng)的血清學(xué)分類方法相比，該方法操作簡單、成本低廉，不用培養(yǎng)大量的鉤體菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可在不同實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，將逐漸成為鉤端螺旋體實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測(cè)、分子流行病學(xué)研究的有利工具。

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