鄒有土，白羊，葛平輝，阮卡，陳星

·技術與方法·

阿達木單抗ELISA定量檢測方法的建立

鄒有土，白羊，葛平輝，阮卡，陳星

治療性單抗藥物已經(jīng)成為生物醫(yī)藥的重要組成部分，在疾病治療上具有廣闊的應用前景，成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應等多種疾病。隨著研究的深入及技術的進步，治療性單抗藥物呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭［1-2］。阿達木單抗是一種全人源的 IgG1型單克隆抗體，可靶向作用于在自身免疫疾病發(fā)病機制中起重要作用的促炎細胞因子——人腫瘤壞死因子（TNF-α）。類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、多關節(jié)型幼年特發(fā)性關節(jié)炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）、銀屑病關節(jié)炎（psoriatic arthritis，PsA）和強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）患者關節(jié)滑液中均發(fā)現(xiàn) TNF-α水平增高，這與炎癥發(fā)生和關節(jié)破壞密切相關［3-4］。阿達木單抗可特異性、高親和地與TNF-α結合，并阻止它與細胞表面 TNF-α受體 p55和p75結合，從而拮抗 TNF-α的生物活性，減少表皮厚度和炎性細胞浸潤［5-6］。

由于阿達木單抗的特殊療效及其巨大的市場份額，許多醫(yī)藥企業(yè)通過生物仿制藥的方式加入到該產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)中。在開發(fā)和生產(chǎn)過程中必須建立起嚴格高效的質量控制方法，而含量的測定是重要的項目控制之一。本研究以hTNF抗原為包被抗原，羊抗人 IgG-HRP為檢測抗體，建立了定量測定阿達木單抗的 ELISA方法，并對該方法進行了方法學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

阿達木單抗注射液（修美樂，Humira）購自美國雅培制藥；牛血清白蛋白（BSA）購自美國 Roche公司；hTNF抗原購自美國 BD Pharmingen公司；TMB購自美國 Fisher Scientific公司；羊抗人 IgG（H+L）-HRP購自美國 Pierce公司；吐溫 20為美國 Amresco公司分裝；其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；苯乙烯 96孔板購自丹麥 Nunc公司；Sunrise型酶標儀購自瑞士 Tecan公司。阿達木單抗發(fā)酵液、空白細胞株（不含阿達木單抗基因的細胞株）發(fā)酵液、輔料溶液（按阿達木單抗注射液處方的輔料組成制得的空白對照品溶液）均為本公司提供。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 將阿達木單抗注射液稀釋至 1 ng/ml，之后再對倍系列稀釋到所需濃度。

1.2.2 含量檢測 用 pH 9.6的包被緩沖液稀釋 hTNF抗原后包被 96孔板，4℃ 過夜。洗板 3次，拍干，加封閉液 200 μl/孔，室溫封閉 2 h，洗板 3次，拍干。加入不同濃度的標準品或待測樣品 100 μl，37℃ 孵育 1 h，洗板6次，拍干，加檢測抗體 1∶10000，100 μl/孔，室溫孵育1 h。洗板 6次，拍干，加 TMB顯色液 100 μl/孔，室溫孵育 15 min，加終止液 100 μl/孔，測定 OD450值。

1.2.3 方法學研究

1.2.3.1 線性范圍 用 0.5 μg/ml的 hTNF抗原包被酶標板，將阿達木單抗注射液稀釋至 8.0 ng/ml，然后進行倍比稀釋，共 16個濃度梯度，每一稀釋度設 3個平行孔，分別加入酶標板，加酶標檢測抗體羊抗人IgG-HRP，顯色，檢測 OD450值，以阿達木單抗?jié)舛葹闄M坐標，相應的 OD450值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3.2 包被濃度與酶標抗體濃度的優(yōu)化 用包被緩沖液將包被抗原 hTNF稀釋至 100、50、20 ng/ml三個濃度，各包被 3條標準曲線試驗所用的酶標孔。用抗體稀釋液將檢測抗體羊抗人 IgG-HRP稀釋至 1∶5000、1∶10000、1∶15000三個濃度，每個濃度的檢測抗體分別加入到 100、50、20 ng/ml三個濃度的 hTNF包被的酶標板上，得到9條標準曲線。

1.2.3.3 靈敏度 空白樣品檢測 10次，計算 10個陰性孔 OD450的平均值（x）和標準差（S），從標準曲線中找到+2S相應值的濃度定為該 ELISA方法的檢測限。根據(jù)標準曲線的線性范圍確定定量限。

1.2.3.4 特異性 對所建立的 ELISA檢測方法進行特異性分析。分別添加曲妥珠單抗、貝伐珠單抗、空白細胞株發(fā)酵液、輔料溶液，考察該方法的特異性。

1.2.3.5 準確度 配制高（0.80 ng/ml）、中（0.20 ng/ml）、低（0.02 ng/ml）三個濃度的阿達木單抗溶液，分別加入到空白細胞株發(fā)酵液中，采用與標準曲線同時測定的方法，在一次實驗中每個濃度點測 5孔，計算平均回收率。

1.2.3.6 精密度 配制高（0.80 ng/ml）、中（0.20 ng/ml）、低（0.02 ng/ml）三個濃度的阿達木單抗溶液，采用與標準曲線同時測定的方法，在一次實驗中每個濃度點測 5孔，計算批內變異系數(shù)。連續(xù)測 5批次，計算批間變異系數(shù)。1.2.3.7 穩(wěn)定性 采用與標準曲線同時測定的方法，即每天新配制標準溶液作標準曲線，連續(xù) 8 d測定并繪制標準曲線，比較曲線的漂移。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 Microsoft Excel統(tǒng)計軟件 t檢驗方法，對阿達木樣品添加干擾物質后測得的 OD450值與單純阿達木樣品的OD450值進行統(tǒng)計學分析，以 P=0.05為顯著性檢驗水準。

2 結果

2.1 線性范圍

以阿達木單抗?jié)舛葹闄M坐標，相應的 OD450值為縱坐標，得標準曲線。實驗結果表明，在 1.0～0.0078 ng/ml的濃度范圍內 OD450和單抗?jié)舛蕊@示出良好的線性關系（r2= 0.9982），回歸方程 y=1.7361x+0.0783，將此濃度范圍定為 ELISA檢測阿達木單抗的線性范圍（圖 1）。

2.2 包被濃度與酶標抗體濃度的優(yōu)化

通過優(yōu)化實驗，共得到 9條標準曲線。實驗結果表明，包被濃度為 50 ng/ml，檢測抗體濃度為 1∶10000時，即能得到線性關系良好的標準曲線（y=0.9703x+0.0503，r2= 0.9995）（圖 2），同時節(jié)約了包被抗原的用量，因此將此條件定為 ELISA檢測阿達木單抗的合適條件。

圖1 ELISA檢測阿達木單抗的標準曲線

圖2 不同包被濃度與檢測抗體濃度的標準曲線

2.3 靈敏度

通過試驗得出此 ELISA方法的檢測限為 0.002 ng/ml；根據(jù)標準曲線的線性范圍，定量限設為 0.0078 ng/ml。

2.4 特異性

添加曲妥珠單抗、貝伐珠單抗、空白細胞株發(fā)酵液、輔料溶液后測得的 OD450值均與無添加阿達木單抗溶液的OD450值相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故該方法的特異性較好。

2.5 準確度

在 5次試驗中，3個濃度點的回收率分別為（91.50± 9.2）%、（86.50±8.0）% 和（80.00±6.8）%（表 1）。

表1 回收率測定結果

2.6 精密度

試驗結果顯示，該檢測方法的批內變異系數(shù)為 11.29%，批間變異系數(shù)為 12.60%（表 2、表 3）。

2.7 穩(wěn)定性

通過連續(xù) 8 d的測定，發(fā)現(xiàn)各點 OD450值無明顯下降，通過線性擬合，相關系數(shù)（r2）都能達到 0.99以上，說明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

表2 批內精密度測定結果

表3 批間精密度測定結果

3 討論

目前常用 ELISA進行藥物蛋白的定量檢測。在重組單抗藥物的發(fā)酵初期，表達量往往比較低，且發(fā)酵液中及純化中間樣品常含有其他的非目的蛋白，采用 ELISA進行定量檢測，其檢測限低，特異性高，可以準確地跟蹤重組單抗藥物的表達及純化情況。

本研究建立了定量檢測阿達木單抗的 ELISA方法，并進行了包被濃度與酶標抗體濃度的優(yōu)化。數(shù)據(jù)顯示優(yōu)化后的ELISA方法在 1.0～0.0078 ng/ml濃度范圍內，線性相關系數(shù)r2=0.9995；檢測限為 0.002 ng/ml，定量限為 0.0078 ng/ml。在高濃度（0.80 ng/ml）條件下回收率為（91.50±9.2）%，中濃度（0.20 ng/ml）條件下回收率為（86.50±8.0）%，低濃度（0.02 ng/ml）條件下回收率為（80.00±6.8）%。同樣，在中高濃度條件下，具有較低的變異系數(shù)（小于 10.0%）。由此可見，在測定阿達木單抗?jié)舛葧r，將樣品稀釋至中、高濃度范圍內，能夠提高檢測的準確度和精確度。實驗還證明成品藥中的輔料成分及檢測樣品中的培養(yǎng)基成分對阿達木單抗的檢測均無干擾；8 d連續(xù)監(jiān)測標準曲線穩(wěn)定性良好。以上數(shù)據(jù)顯示了 ELISA檢測阿達木單抗良好的專屬性、穩(wěn)定性和適用性。

在單抗藥物的含量測定中，可以使用理化的分光光度法、Lowry法和二辛可酸（BCA）法及 HPLC法，還可使用 ELISA法檢測［7］。ELISA法是基于抗體特異性的免疫學方法，用相應的抗原進行包被，如檢測阿達木單抗，則選擇hTNF抗原作為包被抗原，從而具有很高的特異性。同時通過比較免疫學方法和理化方法測定的蛋白含量，還可以獲得總蛋白中具有特異性結合活性的蛋白所占比例的相關信息，但是 ELISA法測定單抗制品中單抗含量的過程中，需對標準品的含量和活性精確標定，否則將使測定結果產(chǎn)生較大的誤差［7］。根據(jù)各項實驗結果表明，建立的 ELISA方法易于操作，快速高效，方法的準確性和精密度良好，可以用于阿達木單抗的含量測定，為該重組單克隆抗體的快速定量檢驗提供了方法學依據(jù)。

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“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2011ZX09202-301-15）

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陳星，Email：15259203827@163.com

2014-12-08